read count 和fpkm数据的数据处理和差异分析

read count 和 fpkm 都是常用的基因表达量数据，其处理和差异分析的步骤如下：

1. 数据预处理：去除低质量的 reads，去除 rRNA 等非 mRNA 序列，使用 HISAT2 或 STAR 对 reads 进行比对，得到每个基因的 read count。

2. 数据归一化：将 read count 转化为 FPKM 或 TPM（Transcripts Per Million）等指标，以消除样本间的测量差异。

3. 差异分析：使用 DESeq2、edgeR、limma 等差异分析工具，对样本间的基因表达量差异进行统计学分析。

4. 选取显著差异基因：根据差异分析结果，选取具有生物学意义的显著差异基因进行后续分析。

需要注意的是，数据处理和差异分析的步骤会因实验设计和数据类型的不同而有所差异，需要根据具体情况进行调整。

相关问题

RNA-seq转录组数据分析R语言

### RNA-seq 转录组数据分析中的 R 语言应用

#### 数据准备
为了进行RNA-seq转录组的数据分析，通常会先将测序读段映射至参考基因组或转录本集合，并统计各基因上的read数目来形成表达矩阵。此过程可以利用多种工具完成，如STAR、HISAT2等用于比对，而HTSeq-count或是featureCounts可用于生成计数表[^2]。

一旦获得了`RNA-Seq_Practice_countstable`这样的文件——它包含了样本中各个基因对应的reads数量，则可将其加载入R环境中以便进一步处理：

counts <- read.table("path/to/RNA-Seq_Practice_countstable", header=TRUE, row.names=1)

#### 计算 FPKM 和 TPM 值
FPKM (Fragments Per Kilobase Million) 及 TPM (Transcripts Per Million) 是两种常用的标准化方法，用来衡量不同样品间以及同一样品内基因表达水平之间的差异。可以通过 `tximport` 或者手动方式实现这些度量指标的转换:

使用 tximport 进行批量导入并自动计算这两种值的方法如下所示：

library(tximport)

samples <- c("sampleA", "sampleB") # 替换成实际样本名称列表
files <- paste0(samples, ".genes.results")

txi <- tximport(files, type="rsem", countsFromAbundance="none")
fpkm_matrix <- as.matrix(txi$abundances[,,"FPKM"])
tpm_matrix <- as.matrix(txi$abundances[,,"TPM"])

write.csv(fpkm_matrix, file="output_fpkm.csv")
write.csv(tpm_matrix, file="output_tpm.csv")

如果选择不依赖额外包而是直接基于原始count table来进行运算的话，那么就需要知道每条记录所代表的目标区域长度信息（可以从GTF/GFF格式的注解文件里提取），进而按照定义公式自行编写函数执行相应的数学变换操作[^4]。

#### 差异表达分析
对于已经过适当预处理后的表达谱数据集来说，接下来往往要做的就是寻找那些在实验条件下表现出显著变化趋势的特征分子。DESeq2是一个非常受欢迎的选择之一，能够很好地适应于此类任务需求：

library(DESeq2)

dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = counts,
                              colData = DataFrame(condition=factor(c(rep("control", n), rep("treated", m)))),
                              design =~ condition)

dds <- DESeq(dds)
res <- results(dds)

summary(res)
plotMA(res, ylim=c(-2,2))

这里假设存在对照(control)与处理(treatment)两组生物学重复(n,m)，并且它们被编码成条件变量(condition)的形式存储起来；通过调用`results()`可以获得关于每个测试对象是否发生了有意义改变的信息汇总报告。

RNA-seq数据表达量原始计数

### RNA-seq 数据表达量原始计数的处理方法

#### 一、概述
RNA-seq技术通过高通量测序来量化基因表达水平，其核心在于将测序读段映射回参考基因组并统计各转录本上的读段数目作为表达量的度量标准[^1]。

#### 二、具体流程

对于获得的RNA-seq数据，在完成质量控制(QC)后，通常采用如下方式来进行表达量计算：

- **比对阶段**

使用支持剪接受体识别的软件如STAR或HISAT2进行读段与参考基因组之间的比对操作。这类工具能够有效地处理跨越多个外显子边界的复杂情况，从而提高后续定量准确性[^2]。

- **特征分配**

经过预处理后的BAM文件会被送入专门用于评估基因/转录本层面丰度的应用程序中进一步解析。FeatureCounts是一个广泛使用的命令行工具，它可以高效地汇总落在指定GTF定义区间内的唯一匹配read count；而RSEM除了提供相似功能之外还允许估计FPKM(TPM)，即每百万片段中的预期分子数(转换为每千碱基)。

featureCounts -a annotation.gtf -o output.txt aligned_reads.bam

- **批效应校正及其他标准化措施**

实验设计往往引入批次差异等因素干扰最终结论的真实性。Combat算法能较好消除此类偏差影响。另外，为了使不同样本间具有可比性，还需要实施诸如CPM (counts per million mapped reads) 或者 TMM(trimmed mean of M-values)这样的规模因子调整策略。

library(edgeR)
cpm_matrix <- cpm(counts, normalized.lib.sizes=TRUE)