CRISPR/CAS9技术构建小鼠胚胎干细胞WDR82标签蛋白表达研究

本文主要介绍了吴昊、张文胜和任文燕等人在中国科技论文在线上发表的一篇关于利用CRISPR/CAS9技术构建内源性WDR82蛋白融合表达的小鼠胚胎干细胞系的研究。CRISPR/CAS9是一种强大的基因编辑工具，它通过同源重组的方式，允许研究人员精确地在目标基因序列中添加或替换特定片段，从而实现基因功能的调控。 研究的目标是利用CRISPR/CAS9技术在小鼠胚胎干细胞（mESCs）中整合Flag和TAP-Flag标签到wdr82基因的终止密码子前，创造出两种带有不同标记的WDR82融合蛋白表达细胞系。wdr82基因编码的WDR82蛋白在细胞生物学中具有重要作用，而添加标签可以帮助追踪和分析其功能及与其他蛋白质的相互作用。 作者们设计了特定的sgRNA（single-guide RNA，单链RNA引导）并在wdr82基因附近构建了包含500bp到1kb左右同源臂的同源重组靶向载体。这个载体携带了Flag和TAP-Flag标签，通过质粒转化法导入小鼠胚胎干细胞中。经过新霉素筛选以去除未转化的细胞，再通过单克隆基因型鉴定和Sanger测序确认获得成功敲入的WDR82融合表达细胞系。 实验结果表明，研究人员成功创建了两种WDR82融合表达细胞系，其敲入效率分别为约11.46%和18.75%。他们利用融合蛋白中的Flag标签进行了Western Blot（蛋白质印迹法）和Co-IP（免疫共沉淀）实验，确认WDR82确实能够与SETD1A/SETD1B复合物的SETD1A和ASH2L亚基发生相互作用。这为进一步研究WDR82的功能以及与相关蛋白质网络的互动提供了实验依据。 关键词涵盖了该研究的关键要素，包括细胞生物学、CRISPR/CAS9技术、小鼠胚胎干细胞和基因敲入，以及研究焦点蛋白WDR82。这篇首发论文对于理解WDR82在胚胎干细胞发育和调控过程中的作用具有重要意义，也为未来利用CRISPR/CAS9技术进行基因编辑研究提供了新的范例。