pET系统操作手册：原核表达与克隆指南

"pET操作手册中文版，由默克公司提供，是关于原核表达系统的详细指南，涵盖了pET载体的选择、克隆策略、蛋白表达调控、宿主菌类型、抗生素抗性等方面内容。" pET系统是一种广泛应用于原核细胞（主要是大肠杆菌）中的蛋白质表达系统，由Novagen公司开发并不断更新。该系统的核心是pET系列载体，它们含有T7启动子，允许通过T7噬菌体RNA聚合酶高效驱动目的基因的转录。手册中详细介绍了pET系统的各个方面： 1. **系统介绍**： - **概况**：pET系统旨在高效表达外源基因，特别适合生产大量重组蛋白质。 - **使用许可及协议**：用户需要了解相关的使用许可和协议，确保合法合规使用。 - **系统组成**：包括pET载体、宿主菌、诱导剂和配套的实验技术。 - **选择合适的pET载体**：考虑因素包括目标蛋白的溶解性、定位，以及是否需要融合标签。 2. **pET载体克隆策略**： - **不带融合标签的天然蛋白**：适用于不需要标签的纯化或研究。 - **带有可切除融合标签的蛋白**：标签可以帮助纯化，但可以通过蛋白酶切除而不影响蛋白功能。 - **Ligation Independent Cloning (LIC)**：一种快速的克隆方法，无需传统的连接反应。 3. **pET系统蛋白表达的调控**： - **T7lac启动子**：在 IPTG 诱导下启动目的基因的转录。 - **pLysS和pLysE宿主菌**：用于减少T7 RNA聚合酶的竞争和抑制毒性表达。 - **含葡萄糖的培养基**：葡萄糖的存在可以抑制T7启动子的活性。 - **pLacI宿主菌**、**pETcoco系统**：提供更多控制表达水平的选择。 4. **宿主菌**： - **克隆宿主菌**：如DH5α，用于构建表达质粒。 - **表达宿主菌**：如BL21(DE3)，适合高效表达；还有蛋白酶缺陷型宿主，利于保持蛋白完整性。 - **补充稀有密码子**：某些宿主菌能提高含有稀有密码子的基因的表达效率。 - **硒代甲硫氨酸标记**：特殊宿主菌可用于硒代甲硫氨酸的定点掺入。 5. **其他关键概念**： - **抗生素抗性**：用于筛选和维持含有pET载体的菌株。 - **CE6噬菌体**：可能用于噬菌体展示或蛋白质的提取。 - **诱导对照**：对比未诱导的菌株，评估诱导后的表达效果。 手册还涵盖了建立原核表达体系的基本步骤，包括操作流程、生长培养基的制备、菌株保存、载体和插入片段的制备、连接反应、转化等实验技术。这些内容对于理解和操作pET系统至关重要，提供了从克隆到表达的完整流程指导。