构建年老大鼠微血管内皮细胞酵母双杂交cDNA文库及TrkB-T1筛选

"利用SMART技术构建年老大鼠微血管内皮细胞酵母双杂交cDNA文库及其筛选" 本文详细介绍了科研人员如何利用SMART（Switching Mechanism At the 5' end of RNA Transcript）技术构建年老大鼠微血管内皮细胞（CMECs）的酵母双杂交cDNA文库，并进行后续的筛选过程，旨在寻找与TrkB-T1受体相互作用的蛋白质。SMART技术是一种有效的工具，常用于全转录组cDNA文库的构建，尤其是对于低丰度或稀有的mRNA分子。 首先，研究人员从20月龄的老年大鼠心脏中分离并培养CMECs。这个过程是通过细胞生物学技术完成的，包括组织消化、细胞贴壁和选择性培养，以确保获取纯化的内皮细胞。接着，他们提取细胞总RNA，这是获取基因表达信息的基础。然后，利用SMART技术进行反转录聚合酶链式反应（RT-PCR），将mRNA转化为双链cDNA（dscDNA）。此步骤中，SMART技术的关键在于其能够有效地延长mRNA的3'末端，形成适合克隆的完整cDNA分子。 dscDNA经过纯化去除短片段后，与线性的载体pGADT7-Rec共转化Y187感受态酵母细胞。pGADT7-Rec是一种常用的酵母双杂交系统中的诱饵质粒，可以容纳插入的cDNA片段。同源重组在酵母细胞内发生，构建了包含老年CMECs cDNA的文库。库容量达到1.75125×10^7cfu，远超过1×10^7cfu的最低要求，这表明文库具有良好的代表性，能覆盖大部分细胞的基因表达谱。 为了筛选与TrkB-T1受体胞内段（ICD）相互作用的蛋白，研究人员使用TrkB-T1 ICD作为诱饵进行酵母双杂交实验。这是一种生物化学技术，通过在酵母中表达蛋白质并检测它们是否能相互结合，从而发现可能的互作蛋白。通过这个过程，他们筛选出了3个阳性克隆，分别命名为GenA，GenB和GenC，这些基因可能编码与TrkB-T1有相互作用的蛋白质。 通过对阳性克隆的测序和同源性分析，科研人员可以进一步解析这些候选基因的功能和结构特征，以了解它们在老年大鼠CMECs中的作用，以及它们与TrkB-T1受体相互作用的机制。TrkB-T1是神经营养因子受体酪氨酸激酶B（TrkB）的一个亚型，参与神经保护和心血管功能的调节。 这项工作展示了SMART技术在构建cDNA文库中的应用，以及酵母双杂交技术在蛋白质相互作用研究中的价值。通过这种方法，研究人员能够深入了解老年大鼠心脏微血管内皮细胞的分子网络，有助于揭示衰老过程中的生理和病理变化，为未来的心血管疾病研究和治疗策略提供新线索。