使用大肠杆菌进行蛋白表达：pET系统操作手册

"Merk-pET_System_Manual.pdf" 是一份详细介绍如何利用大肠杆菌进行蛋白表达的指导手册，由Novagen公司（现归默克中国所有）编写并提供了技术支持。该手册涵盖了从系统介绍、宿主菌选择、克隆策略到原核表达体系建立的全过程。 1. **系统介绍** - pET系统是一个广泛应用于大肠杆菌中的高效表达系统，特别适合生产重组蛋白质。 - 使用许可和协议：手册中可能涉及了使用pET系统的法律条款和授权信息。 - 系统组成：包括pET系列载体、宿主菌、诱导剂和其他辅助元件。 - 选择合适的pET载体：根据目标蛋白的特性（如溶解性、细胞定位）以及是否需要融合标签来决定。 - 载体特性列表：列出了不同pET载体的特点，以供用户选择最适合的载体。 2. **pET载体克隆策略** - 不带融合标签的天然蛋白表达：直接在宿主菌中表达无标签的蛋白质。 - 切除融合标签：通过蛋白酶切去表达的融合标签，得到纯化的目标蛋白。 - 无连接反应的克隆方法（LIC）：一种快速简便的克隆技术，无需常规的DNA连接步骤。 3. **pET系统蛋白表达的调控** - T7lac启动子：控制基因表达的启动，响应诱导剂IPTG的添加。 - pLysS和pLysE宿主菌：这些菌株对T7启动子表达的调控，有助于平衡宿主与表达蛋白之间的竞争。 - 葡萄糖的影响：在培养基中添加葡萄糖可以抑制表达，以避免过早的诱导。 - pLacI宿主菌：LacI蛋白的表达可以影响启动子活性。 - pETcoco™系统：一种优化的表达系统，可能涉及更精细的表达调控机制。 4. **宿主菌的选择** - 克隆用宿主菌：适合DNA克隆和构建表达质粒的菌株。 - 表达用宿主菌：包括蛋白酶缺陷型菌株，用于增强蛋白表达的稳定性；还可以通过调节培养条件统一所有细胞的表达水平；某些菌株能够促进二硫键形成或提高蛋白可溶性；还有针对稀有密码子的优化菌株，用于编码富含稀有氨基酸的蛋白；硒代甲硫氨酸标记菌株则可用于特殊标记。 5. **抗生素抗性**：用于筛选和维持含有重组质粒的菌株。 6. **CE6噬菌体**：可能在表达过程中用于蛋白质的分离纯化。 7. **诱导对照**：在实验中设置诱导前后的对照，以评估表达效率。 8. **建立原核表达体系的基本知识** - 操作流程：从菌株复苏、质粒准备、克隆、转化到诱导表达的完整步骤。 - 生长培养基：包括LB等基础培养基和用于诱导表达的专用培养基。 - 菌株保存：低温或甘油冻存菌株的方法。 - 制备载体和插入片段：DNA纯化和片段切割、连接的技术。 - 转化：将重组质粒引入宿主菌的过程，包括操作技巧和转化效率的提高。 - 铺板技术：用于筛选阳性克隆的平板培养方法。 该手册详细阐述了大肠杆菌表达系统从设计到实现的各个环节，是生物学家和分子生物学家进行蛋白表达研究的重要参考资料。