猪瘟病毒NS5A基因克隆与抗体制备关键技术

本文研究了猪瘟病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV）NS5A基因的克隆、原核表达以及多克隆抗体的制备过程。该研究由蒋大良、刘春红等人合作完成，他们利用PCR技术从携带猪瘟病毒兔化弱毒（Hog Cholera Lapinized Virus, HCLV）全长基因组cDNA的质粒pPOHCLV中，成功地获得了1491 bp长的NS5A基因序列。这个克隆步骤对于理解NS5A基因的功能至关重要，因为NS5A是病毒RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）的重要组成部分，对病毒复制有着关键作用。 接着，研究人员将扩增得到的NS5A基因片段亚克隆到原核表达载体pET-28a(+)上，构建了重组原核表达载体pETNS5A。通过在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行优化表达，结果显示重组蛋白NS5A（rp-NS5A）主要以包含体的形式表达，其分子量约为60 kDa。包含体表达策略有助于保护蛋白质免受降解，为后续纯化提供了便利。 纯化工作采用Ni+亲和层析方法，成功地得到了rp-NS5A。这一步骤对于确保获得纯度高、活性良好的蛋白至关重要，对于后续抗体的制备至关重要。为了验证NS5A蛋白的有效性，研究者用弗氏佐剂乳化免疫的方式，对昆明小鼠进行了多克隆抗体的制备。这样做的目的是为了开发出能够识别和追踪 PEDV NS5A蛋白的抗体，这对于疾病的诊断、疫苗研发以及抗病毒治疗具有潜在的价值。 此外，文章还提到了研究背景，即高等学校博士学科点专项基金课题的支持，以及作者们的学术背景和联系方式。蒋大良作为博士研究生，专注于病原分子生物学和免疫学的研究，而余兴龙教授则担任课题的主要负责人，通过电子邮件沟通研究进展。 这篇论文提供了一个关于猪瘟病毒NS5A基因克隆与表达的详细过程，以及如何利用这个工具来制备多克隆抗体，这些成果对于深入理解猪瘟病毒的生物学特性，以及开发针对该病毒的防控手段具有重要意义。