构建与鉴定HEV ORF3基因稳定表达的HepG2-ORF3细胞系

"HEV ORF3基因真核表达细胞系HepG2-ORF3的构建，是关于猪源戊型肝炎病毒（swHEV）ORF3基因在真核细胞中的表达研究。该研究通过设计引物，扩增ORF3部分基因片段，将其克隆到pcDNA3.1真核表达载体中，然后转染HepG2细胞系，经过G418筛选，最终建立了稳定表达ORF3蛋白的细胞系。实验目的是探究ORF3基因的抗原性，并对构建的细胞系进行了形态学和生长曲线的观察。" 这篇论文详细介绍了构建HEV ORF3基因真核表达细胞系的过程，其主要知识点包括： 1. **HEV ORF3基因**: 戊型肝炎病毒（HEV）是一种RNA病毒，其基因组包含一个开放阅读框（Open Reading Frame, ORF），ORF3编码病毒的非结构蛋白，参与病毒的复制、组装和宿主细胞的相互作用。在本研究中，ORF3基因是研究的重点，因为它可能具有抗原性，即能引发机体免疫反应。 2. **细胞系HepG2**: HepG2是一种源自人类肝癌的上皮细胞系，广泛用于肝功能研究和药物代谢研究。在这个实验中，HepG2细胞被选为ORF3基因的表达宿主。 3. **基因克隆与表达**: 通过设计特异性引物，研究人员成功扩增了swHEV的ORF3基因片段，长度为360bp。这些扩增片段被克隆到真核表达载体pcDNA3.1中，以便在宿主细胞内进行表达。 4. **双酶切鉴定**: 在将基因片段插入载体前，通常会使用限制性内切酶进行双酶切，以确保基因片段正确插入且没有发生突变或反向插入。这一步对于确保基因表达的准确性至关重要。 5. **细胞转染**: 克隆后的重组质粒通过转染方法进入HepG2细胞，使细胞获得ORF3基因，从而在细胞内表达ORF3蛋白。 6. **G418筛选**: G418是一种抗生素，可抑制未转染或转染失败的细胞生长。通过在培养基中添加G418，可以筛选出成功表达ORF3基因并具有抗性的细胞系，即HepG2-ORF3细胞系。 7. **间接免疫荧光检测**: 这是一种常用的检测蛋白质表达的技术，通过用特异性抗体标记ORF3蛋白，然后用荧光标记的二抗检测，可以确定ORF3蛋白是否在细胞中被成功表达。 8. **细胞系形态学和生长曲线观察**: 对于新构建的细胞系，了解其形态变化和生长特性对于评估其稳定性和适合性至关重要。这有助于确认细胞系的生物学特性是否受到ORF3基因表达的影响。 9. **基金支持**: 本研究得到了高等学校博士学科点专项科研基金和现代农业产业技术体系建设专项资金的资助，表明这是一个在学术和应用领域都受到重视的研究项目。 10. **研究意义**: 成功构建的HepG2-ORF3细胞系为研究swHEV ORF3基因的抗原性和功能提供了实验模型，对于理解HEV的感染机制、疫苗开发以及药物靶点研究具有重要意义。