构建并鉴定pEGFP-N1/TNFR1表达载体：绿色荧光蛋白标记TNFR1研究基础

本研究论文主要探讨了"pEGFP-N1/TNFR1载体的构建及鉴定"，由叶顺传、曾秋棠、吴辉文和吕云波等人合作完成，发表于华中科技大学同济医学院协和医院心研所，位于湖北省武汉市。研究的目的是为了构建一个人类肿瘤坏死因子受体(TNF receptor 1，简称TNFR1)的绿色荧光蛋白表达载体，即pEGFP-N1/TNFR1。TNFR1是一种重要的细胞信号受体，在炎症反应和细胞损伤过程中发挥关键作用，尤其是通过激活下游信号通路调控心肌细胞和血管内皮细胞的凋亡。 论文首先介绍了构建过程，通过培养U937细胞，提取RNA并利用RT-PCR技术扩增出TNFR1的cDNA片段。接着，将得到的TNFR1基因片段与pEGFP-N1质粒进行双酶切（SacI和KpnI），然后通过胶回收纯化酶切片段，并在体外通过连接酶进行定向重组。重组后的DNA被转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经过筛选和复苏，最终在含有Kanr的LB固体培养基上获得了阳性克隆。 作者成功地将人TNFR1 cDNA插入到荧光蛋白pEGFP-N1中，这证明了体外重组技术的有效性。这种融合质粒pEGFP-N1/TNFR1不仅便于后续实验观察，如在分子生物学领域中的应用，还能用于研究TNFR1的细胞内转位通路及其调节机制。TNF作为细胞内信号传递的关键分子，其受体的表达和功能研究对于理解炎症反应和疾病进程至关重要。 论文的关键技术和步骤包括RNA提取、RT-PCR、质粒切割和连接、以及大肠杆菌转化，这些都是分子生物学实验的基础。该工作不仅提供了实验验证手段，也为后续在人脐静脉血管内皮细胞中的转染和表达研究打下了坚实的基础，有助于揭示TNFR1在细胞内部的动态调控机制。