ARS/CEN元件游离质粒在巴斯德毕赤酵母稳定性研究

"包含ARS/CEN元件的游离质粒在巴斯德毕赤酵母中的稳定性研究" 在分子生物学和遗传工程领域，巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris，P.pastoris）是一种极其重要的微生物宿主，常用于外源蛋白的高效表达。与大肠杆菌等其他表达系统相比，毕赤酵母能实现更复杂的蛋白质折叠和后翻译修饰，因此在工业生产、药物开发以及基础科学研究中被广泛应用。 当前，整合型质粒是毕赤酵母中最常用的外源基因表达工具，它们通过同源重组永久地插入到酵母染色体中，确保基因的稳定表达。然而，游离型质粒（非整合型质粒）由于在细胞分裂过程中容易丢失，其在毕赤酵母中的应用受到限制。为了克服这一问题，研究人员通常会引入自我复制元件，如启动子、复制起始点（ARS，Autonomously Replicating Sequence）和中心体序列（CEN），以提高游离质粒的稳定性。 本研究中，科研团队将ARS和CEN元件引入到pPIC9K载体中，构建了一种新的游离型质粒pPIC9K-ARS/CEN。这种改造后的质粒能够在毕赤酵母细胞内自主复制，提高了其在细胞内的稳定性。实验结果显示，在没有选择压力的情况下，pPIC9K-ARS/CEN质粒在前10代细胞培养中表现出极高的稳定性，表明ARS/CEN元件的加入显著改善了游离质粒的保留能力。 然而，随着细胞传代培养的进行，质粒丢失的现象逐渐显现。在培养至第20代时，质粒丢失率达到了92.94%，这提示了即使有ARS/CEN元件，游离型质粒的稳定性仍会随时间降低。尽管如此，这些发现对于建立稳定的游离质粒毕赤酵母表达系统提供了理论支持，并为优化质粒设计和实现多基因编辑策略提供了参考。 总结来说，这项研究揭示了ARS/CEN元件对游离质粒在巴斯德毕赤酵母中稳定性的影响，同时也提出了一种质粒消除策略，这将有助于进一步优化酵母表达系统的性能，促进复杂蛋白质工程和基因组编辑的研究。此外，该研究也提醒我们在实际应用中，需要考虑细胞代数对质粒稳定性的影响，以确保目标基因的持续表达。