绵羊GM-CSF基因克隆与酵母表达研究

"绵羊粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF基因的克隆和酵母表达" 本文详细介绍了盛金良、陈创夫等科研人员在绵羊粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因克隆及酵母表达方面的工作。GM-CSF是一种关键的造血生长因子，对于造血调控和免疫系统有显著影响。自1977年首次从小鼠肺部培养液中发现GM-CSF以来，科学家们逐渐揭示了其生物学特性，并成功克隆了不同物种的GM-CSF基因。 研究人员通过使用脂多糖(LPS)诱导绵羊肺泡巨噬细胞，提取总RNA，然后利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增出GM-CSF全长cDNA。扩增得到的cDNA片段被插入pGM-T载体中，经过DNA测序验证后，序列被提交至GenBank，登录号为EU287484。序列全长435碱基对，编码144个氨基酸，与已知的绵羊GM-CSF序列具有99.08%的同源性，推测的氨基酸序列同源性达到98.61%。 为了实现GM-CSF的酵母表达，科研团队将绵羊GM-CSF基因构建到重组表达质粒pPIC9k-GM-CSF中。经过SalI酶切线性化，该重组质粒被电击导入酵母菌株GS115。利用Geneticin梯度培养平板筛选出阳性重组子，最终在4.0%的Geneticin浓度下得到了高拷贝数的阳性菌株。PCR鉴定后，菌株进行甲醇诱导表达，通过SDS-PAGE电泳分析发现，绵羊GM-CSF在大约17千道尔顿(kDa)的位置实现了分泌表达。 这项研究的成功意味着绵羊GM-CSF可以通过基因工程手段得到表达，为进一步研究其生物学活性，如对粒细胞和巨噬细胞的影响，以及开发相关的生物制品，如治疗剂或疫苗，提供了重要的基础。GM-CSF的多种生物学功能，如促进粒细胞和单核细胞的生存、生长、分化和功能增强，使其成为临床研究和应用的焦点。此外，它还能维持造血前体细胞和成熟血细胞的存活，对粒细胞、单核/巨噬细胞等免疫细胞的发育和功能有着至关重要的作用。因此，绵羊GM-CSF的酵母表达系统不仅对于理解哺乳动物的免疫机制具有科学价值，也为未来的兽医学和畜牧业实践提供了新的工具和可能性。