构建与表达：牛白细胞介素-17真核载体在乳腺上皮细胞的研究

"牛白细胞介素-17真核表达载体的构建及在牛乳腺上皮细胞中的表达 (2014年)" 这篇论文详细介绍了关于牛白细胞介素-17（bIL-17）基因的真核表达载体构建及其在牛乳腺上皮细胞中的表达研究。白细胞介素-17是一种由免疫细胞分泌的蛋白质，参与炎症和免疫反应。在本研究中，研究人员旨在体外培养牛乳腺上皮细胞，并构建bIL-17的真核表达质粒，以便在细胞内研究其功能。 【主要步骤与方法】 1. **细胞培养**：首先，研究人员从牛脾脏中提取细胞，通过体外培养技术得到牛乳腺上皮原代细胞。这种方法对于后续的基因操作和细胞功能研究至关重要。 2. **基因扩增**：利用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）从牛脾脏细胞的总RNA中扩增出bIL-17基因。RT-PCR是将RNA转化为DNA并进行PCR扩增的过程，用于获取特定基因的DNA序列。 3. **基因克隆与验证**：扩增的bIL-17基因被连接到pMD19-T载体中，进行测序验证。这是确保基因正确无误的关键步骤。 4. **载体构建**：成功验证后的bIL-17基因被插入到含有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因的真核表达质粒pEGFP-N3上。这种策略使得在细胞中表达的bIL-17可以通过EGFP的荧光来可视化，便于检测表达效率。 5. **细胞转染**：使用脂质体法将构建好的pEGFP-N3-bIL-17质粒转染到牛乳腺上皮细胞中。脂质体是一种常用的非病毒转染方法，能有效将外源DNA送入细胞。 6. **表达检测**：通过荧光显微镜观察EGFP荧光，确认bIL-17基因是否成功在细胞中表达。此外，利用RT-PCR检测bIL-17基因在细胞内的转录水平，以及定量ELISA检测bIL-17蛋白的表达情况。 【结果与结论】 研究成功构建了一个具有双选择标记（绿色荧光和新霉素抗性）的bIL-17真核表达载体，并能在牛乳腺上皮细胞中表达。这为深入理解bIL-17在牛乳腺生理和病理过程中的作用提供了实验基础，也为未来可能的疾病防治或生物技术应用提供了理论支持。 【关键词】 - 牛白细胞介素-17：研究的核心分子，参与免疫调节。 - 载体构建：实现基因在目标细胞中表达的关键步骤。 - 牛乳腺上皮细胞：研究的实验模型，有助于了解bIL-17在乳腺组织的作用。 - 转染：将外源基因导入细胞的技术。 - 表达：指基因转录和翻译成蛋白质的过程。 这篇论文展示了生物医学研究中的一套标准流程，包括细胞培养、基因操作和功能验证，对于理解基因在特定细胞类型中的功能有重要意义。