构建香蕉束顶病毒Rep、MP、Rb和NSP基因酵母双杂交诱饵载体并检测自激活效应

本文主要探讨了香蕉束顶病毒(Banana Bunchy Top Virus, BBTV)的四种关键基因，即Rep、MP、Rb和NSP，如何通过酵母双杂交技术进行研究。作者冯团诚和刘志昕利用染病香蕉假茎和叶片的总DNA作为模板，采用两步法PCR技术高效地获取这些基因。接着，他们利用Gateway™重组技术将这些基因片段分别整合到pDESTTM32这一酵母双杂交系统专用的诱饵载体中，构建出四个独立的诱饵载体：pDESTTM32-Rep、pDESTTM32-MP、pDESTTM32-Rb和pDESTTM32-NSP。 诱饵载体的构建成功，意味着这些基因片段在新的酵母环境中能够稳定表达，并且没有破坏其原有功能。为了验证它们的活性，研究人员将这些诱饵质粒导入MaV203酵母菌株，通过观察酵母细胞在SC-Leu和SC-Leu-Trp这两种缺乏特定氨基酸的营养缺陷平板上的生长情况。结果显示，含有诱饵载体的酵母细胞能在平板上正常生长，说明表达产物对酵母细胞并无毒性。 然而，实验还发现Rep、MP、Rb和NSP这四个蛋白质都具有一定程度的转录自激活作用，即它们可以影响报告基因的表达。这种自激活可能会影响后续的实验结果，因此作者通过添加不同浓度的3-AT（氨基蝶呤）来抑制这种作用，以确保诱饵蛋白在酵母细胞内的活性不会干扰筛选目标蛋白的过程。 这项研究对于理解BBTV的基因功能及其相互作用机制具有重要意义，也为从染病香蕉cDNA文库中筛选出与这些基因相互作用的靶蛋白提供了有效的策略。整个研究过程严谨细致，展示了基因克隆、重组技术和酵母双杂交系统在病毒研究中的应用，为植物病毒学领域的研究者提供了一个有用的工具和技术平台。