实时荧光定量PCR技术详解与关键点分析
需积分: 12 62 浏览量
更新于2024-09-13
收藏 18KB DOCX 举报
"实时定量PCR完全手册"
实时定量PCR(Quantitative Real-Time PCR,简称RT-qPCR)是一种广泛应用在生物化学与分子生物学中的技术,用于精确测定DNA模板的初始浓度。这种方法通过监测PCR扩增过程中荧光信号的实时变化,实现对目标核酸序列的定量分析。
在实时荧光定量PCR的过程中,首先,需要一种荧光标记的引物或探针,这种荧光物质在PCR反应中随产物的累积而增强其信号。每个PCR循环结束后,检测荧光强度,并绘制出荧光扩增曲线,曲线的斜率和截距可以用来计算起始模板的数量。
RT-qPCR通常包括三个主要步骤:
1. 反转录:使用反转录酶将RNA转化为互补DNA(cDNA),这是针对RNA样本的必要步骤。
2. 扩增:通过PCR技术对cDNA进行扩增,通常采用热循环仪进行。
3. 检测:在扩增过程中实时监测荧光信号,以确定目标序列的拷贝数。
RT-qPCR的可靠性和准确性受到多个关键因素的影响:
1. 模板的质量和数量:高纯度、无污染的模板对于获得准确结果至关重要。
2. 反转录反应的标准化:不一致的反转录条件可能导致结果的可变性。
3. 数据分析:必须使用严谨、标准化的分析方法,避免因分析不当导致误导性结果。
然而,RT-qPCR面临的问题主要包括:
1. 不同的操作流程、样本类型(如新鲜、冰冻、固定样本)和样本来源(组织、细胞等)导致定量差异。
2. RNA提取和cDNA合成策略的多样性,如使用不同的酶和试剂。
3. 检测化学方法、反应条件、热循环仪性能以及报告标准的不统一。
4. 缺乏标准化分析流程,影响样品处理、内参选择、归一化方法和质量控制,降低重复性和可信度。
RNA质量评估是RT-qPCR前的关键步骤,不同的定量方法(如Ribogreen、Agilent BioAnalyzer等)可能得出不同的结果。因此,建立统一的RNA定量和质量评价标准对于确保实验的准确性和一致性至关重要。
2013-07-18 上传
2012-12-13 上传
2021-10-04 上传
2021-11-02 上传
2021-04-22 上传
2021-05-08 上传
u010121873
- 粉丝: 0
- 资源: 1
最新资源
- Java集合ArrayList实现字符串管理及效果展示
- 实现2D3D相机拾取射线的关键技术
- LiveLy-公寓管理门户:创新体验与技术实现
- 易语言打造的快捷禁止程序运行小工具
- Microgateway核心:实现配置和插件的主端口转发
- 掌握Java基本操作:增删查改入门代码详解
- Apache Tomcat 7.0.109 Windows版下载指南
- Qt实现文件系统浏览器界面设计与功能开发
- ReactJS新手实验:搭建与运行教程
- 探索生成艺术:几个月创意Processing实验
- Django框架下Cisco IOx平台实战开发案例源码解析
- 在Linux环境下配置Java版VTK开发环境
- 29街网上城市公司网站系统v1.0:企业建站全面解决方案
- WordPress CMB2插件的Suggest字段类型使用教程
- TCP协议实现的Java桌面聊天客户端应用
- ANR-WatchDog: 检测Android应用无响应并报告异常