双脱氧链末端终止法：DNA测序原理与应用升级

DNA测序仪原理及应用深入解析 DNA测序是一种核心的分子生物学技术，它揭示了遗传信息的存储方式，对于遗传学、医学研究、生物技术等领域具有重要意义。本文着重探讨了DNA测序仪的基本原理，以CEQ8000 DNA测序仪为例进行讲解。 双脱氧链末端终止法（Sanger sequencing）是DNA测序的经典方法，由Frederick Sanger等人在1977年开发。这种方法依赖于DNA聚合酶在DNA链延伸过程中，遇到ddNTP（2',3'-双脱氧核苷三磷酸）会终止反应，从而形成不同长度的DNA片段，每个片段的末端核苷酸对应于特定的ddNTP类型。通过放射自显影或现代的非放射性标记物（如生物素、荧光标记）检测这些末端，可以读取并重建DNA序列。 测序过程的关键要素包括单链DNA模板、引物、四种dNTP和DNA聚合酶。模板的选择和引物设计至关重要，早期工作通常依赖于噬菌体单链DNA和限制性内切酶来生成特定片段。然而，天然双链DNA的处理较为复杂，因为需要高效且高质量的单链分离技术，这曾限制了双脱氧链末端终止法的广泛应用。 为了克服这些问题，测序技术不断进步。标记物的改进使得非放射性标记物替代放射性同位素，提高了安全性、便捷性和成本效益。例如，荧光标记物和化学发光物的使用，使得测序结果的检测更加直观且无辐射危害。此外，电泳方法的改进尤其突出，如毛细管电泳（capillary electrophoresis），如Matnies等人的陈列毛细管电泳法，利用激光聚焦和荧光扫描技术，显著提升了测序效率，例如1.5小时内可读取350bp的序列，使得DNA序列分析的速度大大提高，达到每小时6000bp/h。 DNA测序仪的工作原理涉及精确控制DNA链的合成与终止，结合高效的标记物和电泳技术，使得大规模和高通量的测序成为可能。这项技术的发展不仅推动了生物学研究的进展，也为临床诊断、基因工程和生物制药等领域提供了强大工具。随着科技的进步，未来测序技术将继续朝着更高的准确性和速度优化，为生命科学带来更多的突破。