华南象草PpCAD基因原核表达成功构建与初步研究

华南象草（Pennisetum purpureum cv. Huanan）是一种重要的牧草资源，其PpCAD基因在木质素生物合成过程中起着至关重要的作用。木质素是植物细胞壁的主要成分，对于植物的结构强度和防御机制有重大影响。肉桂醇脱氢酶（CAD）作为木质素合成途径的关键酶，其活性调控在植物发育和适应环境变化中具有重要意义。 本文的科研工作主要围绕华南象草的PpCAD基因展开，首先通过已克隆的cDNA序列构建了原核表达载体pGEX-PpCAD。这个载体允许在大肠杆菌（如BL21菌株）中异源表达PpCAD基因，通过融合到含有融合蛋白GEX（Glutathione S-transferase，谷胱甘肽转移酶）的系统中，使得该酶可以在大肠杆菌中被高效表达。选择BL21菌株的原因是其广泛用于基因工程，具有较高的宿主兼容性和易于操作的特点。 研究人员通过调节诱导剂IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）的浓度和温度来优化表达条件。实验结果显示，在0.02 mmol/L的IPTG浓度下，经过28℃诱导1小时，能够获得少量的可溶性融合蛋白，其分子量约为1069 kDa，去除融合蛋白GST部分后，PpCAD的理论大小约为40 kDa，这与预期的理论值相吻合。然而，随着诱导时间的延长，融合蛋白可能会转变为包涵体形式，这是大肠杆菌表达系统中常见的一种现象，可能会影响后续纯化步骤。 值得注意的是，低温和乙醇处理虽然能减缓蛋白质表达的速度，但并不能有效地避免包涵体的形成。这可能提示优化的条件可能需要考虑其他因素，如表达时间、诱导剂类型以及培养条件等。而冻融处理细菌可以作为一种策略来提高包涵体蛋白的提取纯度和丰度，这可能是通过破坏细胞膜和改善蛋白溶解性来实现的。 论文的关键词包括“象草”、“PpCAD”、“原核表达”和“包涵体”，突出了研究的核心内容和方法。本研究为后续深入理解PpCAD的功能及其在木质素生物合成中的作用提供了基础，也为改良华南象草的木质素合成调控提供了可能的工程技术手段。此外，该成果对于其他依赖CAD类似酶的植物研究也具有参考价值。