克隆与表达猪Jiv基因及多克隆抗体制备

"这篇论文是关于猪Jiv基因的克隆、表达以及多克隆抗体制备的研究，属于生命科学领域，特别是分子生物学和免疫学的范畴。" 在这项研究中，研究人员的主要目的是克隆猪Jiv蛋白的核心基因片段，并通过原核表达系统表达和纯化该蛋白，以制备可用于后续实验的多克隆抗体。他们首先采用RT-PCR技术，从猪脾脏组织的RNA中提取并扩增了Jiv基因的2112个碱基对（bp）片段。这个步骤是基因克隆的基础，RT-PCR是一种逆转录聚合酶链式反应，能够将mRNA转化为cDNA，然后通过PCR技术进行特定基因的扩增。 成功获取Jiv基因后，研究者将其插入到pMD19-T载体中，这是一个常用的克隆载体，用于基因的临时存储和序列验证。基因序列验证无误后，他们将Jiv基因插入到原核表达载体pET32a中，构建了pET32a-Jiv。pET系列载体通常包含一个强启动子，能驱动目的基因在大肠杆菌中的高效表达。选择E. coli Rosetta(DE3)作为表达宿主，因为它含有额外的遗传元件，能提高外源基因的翻译效率。 诱导表达阶段，研究人员使用IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）激活T7噬菌体的RNA聚合酶，从而启动目的基因的转录。表达的产物是包含Jiv蛋白的包涵体，包涵体是蛋白质在细菌中过度表达时形成的不溶性蛋白聚合物。接下来，他们通过镍离子螯合层析柱纯化这些包涵体蛋白，这是一种基于His标签的亲和色谱纯化方法，因为pET32a载体通常带有His标签，可以方便地与镍离子结合。 纯化后的包涵体蛋白进行了透析复性，即将蛋白从不溶状态转变为可溶状态，以恢复其生物活性。然后，用这些重组蛋白免疫新西兰白兔，每只兔子的初次免疫剂量为400μg，加强免疫剂量为500μg，共免疫5次。通过间接ELISA检测抗体效价，当达到合适水平时收集抗体，最后使用Western blot技术验证抗体的特异性，确认产生的抗体能特异性识别Jiv蛋白。 这项工作对于理解猪Jiv蛋白的功能，以及可能涉及的疾病机制，如病毒感染等，具有重要意义。同时，制备的多克隆抗体可以用于后续的免疫检测和研究，如感染性疾病诊断、蛋白功能研究以及药物开发等。