一管nested-PCR：高效 SNP 基因型分型的新方法

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"本文主要探讨了One tube nested-PCR (一次管内嵌套PCR)技术在单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)基因型分型中的应用，发表于2015年的《湖南农业大学学报(自然科学版)》第41卷第2期。这项研究由张羽等人进行，他们在陕西理工学院生物科学与工程学院和陕西省农业科学研究所合作，关注的是如何在水稻基因研究中提高SNP检测的效率。 nested-PCR技术是对传统PCR技术的一种改进，它特别设计用于检测个体间的遗传变异，即SNPs。在研究中，作者选取了水稻香味基因Fgr和稻瘟病抗性基因Pi–ta、Pi9、Pigm作为示例，通过将四个针对SNP位点的功能标记引物整合到一管PCR反应中，这种方法能够同时扩增出含有突变位点的DNA片段，实现了快速且高效的SNP基因型分型。优化引物浓度梯度和改良反应程序是关键步骤，这有助于提高PCR反应的特异性和敏感性，确保了对SNP位点的精确识别。文章强调了一步法操作的重要性，即在一个PCR反应中完成所有必要的步骤，这不仅节省了时间和资源，还减少了潜在的误差来源。关键词“nested-PCR”、“单核苷酸多态性”和“基因型分型”揭示了论文的核心内容，表明了作者对于如何利用这一技术在实际遗传学研究中进行高通量、准确的SNP分析有着深入的探讨。这项工作对于提升农作物遗传育种、疾病诊断和分子标记辅助选择等领域具有重要意义，也为其他研究人员提供了实用的实验策略和技术指导。"

湖南农业大学学报(自然科学版) 2015 年 4 月第 41 卷第 2 期

Journal of Hunan Agricultural University (Natural Sciences), Apr. 2015, 41(2):136–142

DOI:10.13331/j.cnki.jhau.2015.02.005

投稿网址：http://xb.hunau.edu.cn

One tube nested-PCR 在 SNP 基因型分型中的应用

张羽

，张晓娟

，王胜宝

，宋晓利

，李小刚

(1.陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西汉中 723000；2.陕西省农业科学研究所，陕西汉中 723000)



摘要：nested–PCR 是一种在普通 PCR 基础上发展起来的专门用于检测单核苷酸多态性(SNP)的技术。结合

nested–PCR 技术在水稻中检测 SNP 的研究，以 1 个水稻香味基因 Fgr 和 3 个稻瘟病基因 Pi–ta、Pi9、Pigm 为例，

把 nested–PCR 的 4 条引物同时加在一管 PCR 反应中进行扩增，在其序列内针对 SNP 位点设计功能标记，用来扩

增含有突变位点的 DNA 片段。通过优化引物浓度梯度和改良反应程序，达到了一步快速检测 SNP 基因型的目的。

关键词：nested–PCR；单核苷酸多态性；基因型分型

中图分类号：Q789 文献标志码：A 文章编号：1007−1032(2015)02−0136−07

Application of one tube nested-PCR on genotyping of SNP

Zhang Yu

, Zhang Xiaojuan

,Wang Shengbao

, Song Xiaoli

, Li Xiaogang

(1.School of Biological Sciences and Engineering, Shaanxi University of Technology, Hanzhong, Shaanxi 723000, China;

2.Hanzhong Institute of Agricultural Sciences, Hanzhong, Shaanxi 723000，China)



Abstract: Based on common PCR, nested–PCR technology was developed to specially detect single nucleotide

polymorphism (SNP). In this study, one tube nested–PCR technique was adopted to explore SNPs in four structural genes

of rice, there were Fgr, a rice aroma gene and Pi–ta, Pi9 and Pigm, three rice blast resistance genes. Primers with

effectively marked at targeting SNP sites were designed and four primers were mixed in one tube to amplify DNA

fragments harboring mutation sites. In addition, reaction conditions including primer concentration and PCR program

were optimized to identify different SNP genotypes in one step. Therefore, the one tube nested–PCR provided a feasible

and efficient strategy to analyze SNP genotypes.

Keywords: nested–PCR; single nucleotide polymorphism (SNP); genotyping

收稿日期：2014–10–13 修回日期：2015–01–20

基金项目：陕西省科学技术厅农业科技攻关项目(2013K02–10–01)；陕西省科学技术厅农业科技创新项目(NKC01–01)

作者简介：张羽(1968—)，女，陕西汉中人，硕士，教授，主要从事遗传学理论与实践研究，zy68169@sina.com

单核苷酸多态性(single nucleotide polymer-

phism，SNP)主要是指由于基因组核苷酸水平上的

单碱基的转换、颠换以及单碱基的插入或缺失变异

引起的 DNA 序列多态性，是许多物种基因组中最

常见的变异形式，在基因组中的分布频率很高。SNP

在人类

[1]

、老鼠

[2]

、拟南芥

[3]

、大麦

[4–5]

、大豆

[6]

、

甜瓜

[7]

、玉米

[8]

和水稻

[9–12]

等多个物种中的高密

度分布已有报道。作为第 3 代分子标记的 SNP，在

基因组中数量多，分布密度高，特别是由于其不需

要根据片段大小将 DNA 分型，因此，可以用高通

量基因芯片技术自动化完成基因分型。目前，检测

SNP 的方法有很多种，但有的需要昂贵的设备及试

剂；有的检测过程繁琐，适合于普通实验室检测的

不多。传统的 nested–PCR(巢式 PCR)是一种 PCR 改

良模式，它由 2 轮 PCR 扩增和 2 套引物对组成。首

先利用外引物对 DNA 进行第 1 轮扩增，然后以第 1

次 PCR 反应的产物作为模板进行第 2 轮扩增，第 2

次 PCR 引物与第 1 次反应产物的序列互补，第 2

次 PCR 产物即为目的基因

[13–16]

。其优点在于：如

果第一次扩增产生了错误片断，那么，第二次能在

错误片段上进行引物配对并扩增的几率是很低的，

因此，巢式 PCR 的扩增特异性强，且传统的巢式

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