人hTCTP基因克隆与原核表达研究

"人TCTP基因的克隆与原核表达 (2011年)"，作者许婉芳，李祖剑，发表于《井冈山大学学报(自然科学版)》，主要涉及生物技术领域，具体是关于翻译控制肿瘤蛋白（hTCTP）的研究。 翻译控制肿瘤蛋白(hTCTP)，全称为Translationally Controlled Tumor Protein，是一种在进化过程中具有高度保守性的蛋白质，其表达水平在多种生物体中都很高。这个基因家族在细胞生长、凋亡、应激反应以及肿瘤发生发展中起着重要作用。本研究的主要目标是克隆并实现人源hTCTP基因在原核系统中的表达，以便进行进一步的功能研究和潜在的应用开发。 实验方法采用了聚合酶链式反应(PCR)技术，这是一种广泛用于分子生物学的基因扩增技术。通过对人hTCTP基因的特异性引物设计，研究人员能够准确地从模板DNA中扩增出该基因片段。扩增后的基因片段经过适当的限制性内切酶酶切，然后被插入到表达载体pGEX-4T-2中。pGEX-4T-2是一种常用的GST（谷胱甘肽-S-转移酶）融合蛋白表达载体，可以确保目的基因在大肠杆菌中高效表达。 将构建好的表达载体转化到大肠杆菌中后，通过菌落PCR和质粒酶切鉴定，可以筛选出含有正确插入片段的阳性菌株。菌落PCR是对单个菌落的DNA进行快速检测的方法，而质粒酶切鉴定则能确认基因片段是否正确插入并保持完整。这两步验证确保了hTCTP基因的成功克隆。 在确认克隆成功后，研究人员通过添加诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组大肠杆菌表达hTCTP基因编码的蛋白。IPTG能激活lac操纵子，使得目的基因在宿主细胞中得到表达。表达的hTCTP蛋白随后通过超声破碎法释放出来，并利用亲和层析技术进行纯化。亲和层析是基于蛋白质特定性质（如GST标签）的纯化方法，能有效地分离和收集目的蛋白。最后，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对纯化的蛋白质进行分析和鉴定，以确定其质量和完整性。 这个研究不仅展示了hTCTP基因的克隆和表达策略，也为后续的生物学功能研究提供了基础。例如，通过这种方式表达的hTCTP蛋白可用于细胞或动物模型中研究其在肿瘤发生、细胞调控等方面的作用，也可以作为药物靶点进行抗肿瘤药物的研发。此外，这种技术也适用于其他基因的克隆和表达研究，对于生物医学研究和生物技术产业具有重要意义。