构建与表达：荧光标记人PDCD4基因重组腺病毒

"人PDCD4基因重组腺病毒的构建和表达" 本文是一篇关于构建和表达人PDCD4基因重组腺病毒的首发论文，由曲忠花和高飞等人完成。研究的主要目标是建立一个荧光标记的PDCD4基因，即在人程序性细胞死亡4基因（PDCD4）上添加了荧光蛋白EGFP（增强型绿色荧光蛋白），以便于观察和追踪该基因在细胞中的表达和定位。 PDCD4是一种参与细胞凋亡过程的重要蛋白质，它的功能与细胞周期调控、肿瘤抑制和免疫调节等生物学过程密切相关。通过重组腺病毒作为载体，研究人员可以更有效地将PDCD4基因导入目标细胞，研究其生物学效应。 在实验方法中，首先利用PCR（聚合酶链式反应）技术设计并合成引物，扩增出带有重组臂的attB1-human PDCD4序列和EGFP-attB2序列。然后通过重叠PCR将这两段序列连接成attB1-human-PDCD4-EGFP-attB2全长片段，将其克隆到pMD18-T载体中进行初步验证。接下来，利用Invitrogen公司的BP重组系统将目的片段转移到pDONR221载体上，再通过LR重组系统将该序列插入腺病毒载体pAD/CMV/v5-DEST。这一系列步骤是为了确保重组基因能被稳定地整合到腺病毒中。 成功构建重组病毒载体后，研究人员通过PacI酶切并转染293A细胞来包装病毒。293A细胞是常用于腺病毒包装的细胞系，因其易于感染和高效率的病毒生产而被广泛使用。经过病毒的扩增和收集，最终测得的病毒滴度为2.2×1011 ifu/ml，表明构建的重组腺病毒具有高滴度，适合后续实验应用。 实验结果显示，PCR和测序分析都证实了重组腺病毒载体的序列正确，这表明EGFP与PDCD4基因成功融合，并且能够在病毒感染的细胞中表达。这项工作为未来对PDCD4基因的深入研究提供了重要的工具和基础，有助于揭示PDCD4在细胞凋亡、肿瘤发生和免疫应答等领域的具体作用机制。同时，该研究方法和技术也可为其他基因的研究提供参考和借鉴。