黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因克隆与毕赤酵母分泌表达研究

"黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因克隆及在毕赤酵母中分泌表达 (2012年)" 这篇论文是关于生物技术领域中的基因工程和酵母表达系统，具体涉及黑曲霉(Aspergillus niger)的β-葡萄糖苷酶基因(bgl)的克隆和在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的分泌表达。该研究的主要目标是大规模制备β-葡萄糖苷酶，这是一种在工业应用中具有重要价值的酶。 首先，研究者依据已有的黑曲霉β-葡萄糖苷酶cDNA序列设计并使用RT-PCR（反转录聚合酶链式反应）技术扩增出bgl基因。RT-PCR是一种用于从mRNA中获取特定基因序列的方法，它结合了反转录和PCR两步过程，能够将mRNA转化为cDNA，并通过PCR扩增目标基因片段。 接下来，他们构建了一个克隆载体pMD-18T-bgl，这个载体可以暂时存储bgl基因。然后，bgl基因被亚克隆到一个表达载体pPIC9K中，这是一个在毕赤酵母中常用的表达系统，特别适合分泌表达外源蛋白。pPIC9K载体含有一系列控制元件，如AOX1启动子，可以在甲醇诱导下驱动目的基因的表达。 完成基因构建后，研究人员将线性化的pPIC9K-bgl通过电转化法引入毕赤酵母GS115中。电转化是一种将外源DNA导入微生物细胞的技术，利用瞬时的高电压脉冲打开细胞膜，允许DNA进入。通过MD和YPD/G418平板筛选，他们成功获得了能分泌表达β-葡萄糖苷酶的重组毕赤酵母菌株。 实验结果显示，通过添加1%的甲醇诱导，重组毕赤酵母分泌了一种分子质量约为90000道尔顿的蛋白质，这与bgl基因预期编码的蛋白质相符。进一步的酶活性测定表明，这种酶在50°C和pH5.5条件下表现出最佳催化活性，酶活达到了38U/mL，相比之前报道的重组酶水平有显著提升。 这篇论文详细描述了如何通过基因工程技术克隆黑曲霉的β-葡萄糖苷酶基因，并在毕赤酵母中实现其高效分泌表达。这种方法对于提高酶的生产效率和规模具有重要意义，特别是在生物制药、食品加工和生物质能源等领域有着广泛的应用前景。同时，它也为其他真菌酶的克隆和表达提供了参考策略。