构建与鉴定CTCF/pEGFP-N1过表达与shRNA载体：关键技术与应用

本文报道了刘秋英、谢晓砚等研究人员在中国科技论文在线上发表的关于构建CTCF/pEGFP-N1过表达载体和CTCF-shRNA真核表达载体的研究。他们的目标是通过这些载体的构建，实现CTCF蛋白的过量表达以及对CTCF基因的特异性沉默，为后续深入研究CTCF在生物学过程中的功能提供实验工具。 首先，研究者利用pGEM-7Zf(-)/CTCF质粒，通过EcoRI酶切回收并纯化出编码CTCF的DNA片段。然后，这部分片段被亚克隆到经过EcoRI酶切处理的pEGFP-N1载体中，形成CTCF/pEGFP-N1融合质粒。该步骤涉及到基因工程的基本操作，即质粒的克隆和整合，目的是使CTCF基因得以高效表达，并与绿色荧光蛋白（EGFP）融合，便于后续的观察和追踪。 接下来，研究人员设计并体外合成针对人CTCF基因的shRNA寡核苷酸片段。这些短的双链RNA片段能够与特定的mRNA结合，导致mRNA的降解，从而实现基因沉默。这些shRNA片段被克隆到线性化的pSIREN-Shuttle质粒中，形成CTCF-shRNA表达载体。这个过程涉及RNA干扰技术，利用shRNA来靶向调控特定基因的表达。 通过酶切鉴定和测序分析，研究人员确认了CTCF/pEGFP-N1融合质粒中CTCF基因的成功插入，以及CTCF-shRNA表达载体中shRNA片段的正确整合。这些结果证明了构建的载体是有效的，并且符合预期的设计。 该研究还得到了资金支持，包括高等学校博士学科点专项科研基金和国家自然科学基金，这表明其学术价值和实际应用前景。作者刘秋英专注于肝癌的表观遗传学，而覃扬教授则在肿瘤细胞增殖与凋亡以及人肝癌表现遗传学方面有所建树。 总结来说，这项研究不仅展示了构建和鉴定复杂基因表达载体的技术，也提供了利用RNA干扰技术调控基因表达的实验策略，对于理解CTCF在细胞生物学中的作用以及开发相关的治疗手段具有重要意义。