里氏木霉纤维素内切酶Ⅲ在大肠杆菌中的原核表达

"纤维素内切酶Ⅲ原核表达载体构建" 这篇论文涉及的是生物技术领域，特别是关于真菌纤维素内切酶III（EgIII）在原核生物中的表达研究。纤维素内切酶是一种能分解纤维素的大分子糖苷水解酶，对于生物质转化和生物能源的开发具有重要意义。里氏木霉（Trichoderma reesei）是一种常见的丝状真菌，因其高效分泌纤维素酶而被广泛研究。 研究人员李丹和蒋彦采用RT-PCR（反转录聚合酶链反应）方法，从里氏木霉中提取总RNA，并以此为模板合成纤维素内切酶III的cDNA（互补DNA）。RT-PCR是将mRNA转化为cDNA的过程，用于后续的DNA操作，如克隆和序列分析。他们成功获得了约750bp的EgIII cDNA片段。 之后，这个cDNA片段被插入到T载体中进行测序验证，确保其正确性。然后，通过酶切连接技术将其插入到pET-28b克隆载体中。pET-28b是一种常用的原核表达载体，含有一个His-Tag标签，有助于目的蛋白的纯化。通过PCR和双酶切鉴定，确认了EgIII基因的正确插入，从而形成有效的表达载体。 接下来，该克隆子被转化至大肠杆菌BL21菌株中。BL21是一种常用的表达宿主，因为它能高效地表达外源蛋白。通过添加IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导目的基因的表达。诱导后的菌体经过免疫印迹（Western Blot）检测，证实EgIII蛋白在大肠杆菌中被表达出来。此外，还进行了活力测定，评估了EgIII在大肠杆菌中表达的活性。 论文还提到，EgIII在尿素中发生的变性是可逆的，这意味着在特定条件下，即使蛋白经历了变性过程，仍能恢复其功能，这对于蛋白质的稳定性和应用具有积极意义。 关键词：里氏木霉、纤维素内切酶III、原核表达 这项工作展示了在原核系统中表达真菌来源的纤维素内切酶的技术路线，为生物工程和工业应用提供了可能，特别是在利用纤维素作为可再生资源的生物转化过程中。同时，研究结果也为进一步优化表达条件、提高酶活性和稳定性提供了基础。