CLONTECH酵母双杂交技术手册

"CLONTECH酵母双杂中文版.doc" CLONTECH的酵母双杂交系统是一种广泛应用于蛋白质相互作用研究的技术，尤其在鉴定未知蛋白质伴侣、酶的底物以及信号传导通路中蛋白质间的相互作用时非常有用。这份文档详细介绍了如何使用该系统进行实验操作。 1. 介绍 酵母双杂交技术是基于酵母细胞内的转录激活机制，通过将蛋白质相互作用转化为酵母生长或报告基因表达的可检测事件。该技术结合了蛋白质与DNA结合（单杂交）和蛋白质-蛋白质相互作用，使得在体内环境下检测蛋白质间的相互作用成为可能。 2. 试剂盒物品清单和附加物品 文档列出了实验所需的各种试剂、菌株、载体等，包括酵母菌株、酵母载体、构建文库所需的试剂等，这些都对实验的成功至关重要。 3. 酵母菌株和载体 酵母菌株如AH109和Y187具有特定的基因型和表型，适合用于酵母双杂交实验。酵母载体则设计有特定的融合标签，能够帮助研究人员将感兴趣的蛋白质片段插入并表达。 4. 方法简述 - 单杂交文库的构建和筛选：涉及将目标DNA序列插入到报告质粒中，然后转化酵母细胞，通过筛选能够激活报告基因表达的酵母菌株来发现能够结合特定DNA序列的蛋白质。 - 双杂交文库的构建和筛选：涉及到两个融合蛋白质的表达，一个与DNA结合域（BD）融合，另一个与激活域（AD）融合。当两者相互作用时，可以激活报告基因的表达。 5. 文库构建和筛选 包括cDNA文库的构建，通过逆转录合成双链cDNA，然后克隆到酵母载体中。筛选过程可能通过酵母配对或共转化方法，以鉴定能够相互作用的蛋白质。 6. 分析阳性相互作用结果 阳性结果通常通过检测报告基因（如His3、ADE2、LacZ等）的活性来确认，这表明存在蛋白质-蛋白质或蛋白质-DNA相互作用。 7. 问题解决指南 文档提供了遇到实验问题时的解决策略，以帮助研究人员排除实验障碍。 8. 相关产品和附录 提供了其他可能需要的试剂、工具和实验数据示例，以及酵母感受态的制备方法、对照载体信息等。 该文档为酵母双杂交实验提供了一个全面的指南，不仅详细阐述了实验步骤，还包含了丰富的图表和表格，以协助研究人员理解和执行实验。通过对酵母双杂交系统的深入理解，研究人员可以有效地探索和解析复杂的蛋白质网络。