DNA改组技术优化赖氨酸脱羧酶基因cadA和ldc的定向进化研究

“通过DNA改组技术定向进化赖氨酸脱羧酶基因cadA和ldc (2015年)” 这篇论文探讨了利用DNA改组技术对赖氨酸脱羧酶基因进行定向进化的研究。赖氨酸脱羧酶是一种关键的生物催化剂，参与氨基酸代谢，能将赖氨酸转化为其他化合物，如1,5-戊二胺。在这个研究中，科研人员针对两种不同的赖氨酸脱羧酶基因——cadA和ldc进行了工作。 首先，研究人员从大肠杆菌Escherichia coli JM109和蜂房哈夫尼菌Hafnia alvei AS1.1009中分离出了这两种基因。通过NCBI数据库的比对，他们发现cadA和ldc的同源性达到了75%，这意味着它们在结构和功能上存在一定的相似性，但也有足够的差异进行优化。 接下来，研究人员构建了重组质粒pTrc99a cadA和pTrc99a ldc，这是两个基因表达的载体。使用PCR技术扩增目的基因片段，并分析了这些片段中存在的限制性酶切位点。通过限制性内切酶的切割，基因被分解为不同长度的片段，为后续的DNA改组提供了材料。 DNA改组是一种人工模拟自然进化的过程，它通过随机重组这些基因片段，创建了一个赖氨酸脱羧酶的突变体库。这个库在大肠杆菌JM109中表达，以筛选出具有改善性能的突变体。经过两轮筛选，即LBXL平板初筛和高效液相色谱（HPLC）复筛，研究人员成功找到了一个名为LDC216的突变体，其比酶活（酶活性与总蛋白质量之比）显著提高，达到4869.86 U/mg，相比于野生型的CadA（1652.63 U/mg）和Ldc（2365.93 U/mg），分别提高了2.95和2.06倍。 在最优条件下（37℃，pH 6.0），这种突变体表现出更强的催化效率。在摇瓶发酵5小时后，目标产物1,5-戊二胺的产量从46.9 g/L提升至63.9 g/L，提高了36%，显示出该突变体在工业生产中的潜在优势。 这项研究利用DNA改组技术成功地优化了赖氨酸脱羧酶基因，提高了酶的活性和产物产量，对于生物工程和发酵工程领域具有重要意义，特别是在氨基酸代谢和化学品生产的应用中。此外，这种定向进化的方法也为其他酶类的改造提供了参考策略。