重组大鼠溶菌酶N端多肽原核表达及对AGEs结合作用研究

"重组大鼠溶菌酶N端多肽的原核表达及其对晚期糖基化终产物的结合作用 (2006年)，自然科学论文" 这篇2006年的自然科学论文研究了大鼠溶菌酶N端多肽片段的重组与原核表达，并探究了该重组多肽与晚期糖基化终产物（AGEs）的相互作用。实验通过以下步骤进行： 1. **基因提取与重组**：从SD大鼠的外周血白细胞中提取总RNA，利用逆转录技术将RNA转化为cDNA，随后扩增溶菌酶N端基因片段。这一过程是基因工程的基础，使得研究人员能够获取目标基因序列。 2. **构建表达载体**：将扩增的基因片段插入到pET-30a(+)质粒中，创建了表达质粒pLY77。pET系列质粒是常用的原核表达系统，常用于编码蛋白质的表达。 3. **原核表达**：将含有pLY77的工程菌Rosetta(DE3)在适当的条件下诱导表达。Rosetta(DE3)菌株是一种改良的大肠杆菌，能提高外源基因的翻译效率，特别是含有稀有密码子的基因。 4. **蛋白质纯化**：表达的重组多肽通过Ni+-NTA琼脂糖柱层析纯化，这是一种基于金属亲和色谱的纯化方法，利用重组蛋白的His标签与镍离子的特异性结合来纯化蛋白质。 5. **功能验证**：纯化的多肽片段LY77通过SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）和Western印迹法进行鉴定，证明其正确表达和纯化。随后，采用ELISA法评估其与AGEs的结合活性，发现LY77具有显著的结合能力。 6. **结果分析**：LY77在大肠杆菌中高效表达，以可溶性蛋白形式存在，分子量约为110kDa。它能有效结合体外制备的晚期糖基化蛋白BSA-AGEs，显示出对AGEs的高亲和力。 7. **科学意义**：这些结果表明LY77可能有潜力作为工具或治疗靶点，促进体内AGEs的清除，可能参与免疫调节作用。这为未来深入研究LY77在糖尿病并发症和其他与AGEs相关的疾病中的潜在应用提供了理论基础。 这篇论文涉及了分子生物学、生物化学和微生物学等多个领域的知识，包括基因操作、蛋白质表达和纯化、以及生物分子相互作用的研究方法。