二代测序技术：从数据下载到RNA-seq分析

"二代测序总结，包括原始sra数据的下载、基因组注释文件与参考数据的获取，以及RNA-seq分析流程，重点介绍了使用hisat2和stringtie进行差异基因分析的方法。" 在生物信息学领域，二代测序（Next-Generation Sequencing, NGS）技术已成为研究基因表达、转录调控等生物学问题的重要手段。本资源主要涵盖了从原始测序数据的处理到差异基因分析的一系列步骤。 首先，原始sra测序数据的下载通常通过NCBI的SRA工具套件（sratoolkit）中的prefetch命令实现。通过提供SRR编号，可以下载对应样本的所有runinfo信息。此外，也可以通过EBI网站获取srx编号来下载所需的数据。 RNA-seq分析方面，早期常用的方法是Tophat和cufflinks组合，但目前更倾向于使用hisat2和stringtie。hisat2是一款高效的比对工具，能快速准确地将RNA-seq读段比对到参考基因组上。stringtie则用于转录本组装和定量，同时可以进行差异表达分析。 在Linux环境中，hisat2和stringtie的安装简单，只需下载对应的二进制文件并设置环境变量。例如，通过`export PATH=$PATH:xxxx`将它们的路径添加到系统路径中。构建hisat2索引时，使用`hisat2-build`命令，指定基因组文件和名称。转换sra为fastq格式，需要 sratoolkit 中的`fastq-dump`工具。 比对过程使用hisat2，参数包括 `-p`（线程数）、`-x`（索引文件）、`-1`和`-2`（分别表示第一和第二末端的fastq文件），输出为SAM格式的比对文件。SAM（Sequence Alignment/Map Format）是一种标准格式，记录了测序数据与参考基因组的比对信息，包括比对结果和各种元数据。SAM文件可以进一步转化为更紧凑的二进制BAM格式，便于后续分析。 在比对完成后，stringtie可以用来处理SAM文件，进行转录本组装和基因表达量估计。通过stringtie的`-e`参数进行表达量估计，结合`--merge`参数合并多个样本结果，最后使用`-b`参数输出GTF文件，以进行差异基因分析。 差异基因分析通常基于统计学方法，如DESeq2或edgeR，比较不同条件或样本组间的基因表达变化。这些差异基因可以作为生物学功能研究和通路富集分析的基础，揭示不同条件下的生物学过程差异。 这个资源提供了二代测序数据分析的一个简明流程，涵盖了从原始数据到差异基因挖掘的关键步骤，对于生物信息学初学者和研究人员来说，是非常实用的指南。