2010年：海参溶菌酶基因在毕赤酵母中的高效表达与纯化策略

本研究论文详细探讨了海参溶菌酶（Stichopus japonicus lysozyme，SJL）在毕赤酵母（Pichia pastoris）中的克隆和表达纯化的技术过程。首先，研究人员从海参肠组织中提取总RNA，利用已知的SJL基因序列（GenBank accession No. EF036468）设计引物，通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）获得了目的基因。这个目标基因随后被整合到表达载体pPIC9K中，形成了重组质粒pPIC9K-SJL。毕赤酵母GS115被用作宿主细胞，通过多种培养基如MD、MM和添加抗生素G418的YPD平板，筛选出具有His+Muts表型的高拷贝阳性菌株，这些菌株具备了SJL基因的高效表达能力。 挑选出来的具有抑菌活性的酵母菌株被用于甲醇诱导的液体发酵过程中。发酵产生的上清液经过硫酸铵沉淀和透析步骤，初步得到了溶菌酶的粗品。接着，通过CM52纤维素阳离子交换柱进行进一步纯化，最终获得了电泳纯度极高的溶菌酶产品。研究结果表明，成功筛选到了7株具有抑菌活性的重组酵母菌株，其中在诱导72小时时，溶菌酶的表达量达到最高，证明了SJL在毕赤酵母中的有效表达和应用潜力。 这篇论文不仅展示了科研人员对海洋生物资源的开发利用，还涉及到分子生物学技术、基因工程和发酵工程技术的结合，对于理解海参溶菌酶的工业化生产途径以及优化微生物表达系统具有重要的科学价值。此外，它也对生物制药、食品工业和生物防腐等领域可能的应用提供了理论支持。关键词包括海参溶菌酶、毕赤酵母、表达和纯化，这表明了研究的热点和实用性。整个研究过程遵循了严格的科学方法，展现了严谨的实验设计和细致的操作步骤，对于相关领域的研究者具有很高的参考价值。