构建C1ql1基因酵母双杂交诱饵载体:自激活活性与毒性评估
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更新于2024-09-05
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本研究聚焦于小分泌蛋白C1ql1的功能探索,目标是通过构建酵母双杂交系统来钓取其相互作用蛋白。作者陈冉、廉滋珍等人在实验中设计了一种策略,即构建了pGBKT7-C1ql1酵母双杂交诱饵载体,这是一种常用的遗传工具,用于检测蛋白质间的相互作用。C1ql1基因,源于小鼠(mC1ql1),其信号肽被去除后连接到酵母双杂交系统的核心元件pGBKT7中。
构建过程采用PCR技术扩增目标基因片段,并通过醋酸锂转化法将其导入酵母Y2HGold菌株,这是一种广泛应用于酵母双杂交研究的宿主菌。实验中,关键步骤包括对重组pGBKT7-mC1ql1载体的分子生物学验证,如通过PCR、EcoRI/BamHI双酶切和测序确认基因插入位置和序列正确性。
为了评估诱饵载体的自激活活性,研究人员在两种不同的培养基上进行实验:SD/-Trp/X-α-gal(基本培养基加缺乏色氨酸和X-α-gal指示剂)和SD/-Trp/X-α-gal/AbA(进一步去除了脯氨酸)。结果显示,在标准培养基上未观察到蓝色菌落(通常表示转录产物的表达),而在去除了脯氨酸的添加物中也未见菌落生长,这表明pGBKT7-mC1ql1诱饵载体在Y2HGold菌株中并未自我激活。
此外,实验还进行了毒性检测,以确保载体不会对酵母造成有害影响。结果显示,诱饵载体对酵母菌株Y2HGold无明显毒性,这对于后续的互作蛋白筛选是积极的信号,因为它表明构建的载体是安全且有效的,可以用于C1ql1的蛋白质伙伴筛选。
该研究成功构建了C1ql1基因的酵母双杂交诱饵载体,并通过自激活检测证明了其稳定性和选择性。这对于理解C1ql1蛋白的功能以及发现其可能的相互作用伙伴具有重要意义,为后续的生物学研究提供了坚实的基础。关键词包括C1ql1基因、酵母双杂交诱饵载体、自激活、以及毒性检测,这些领域都是分子生物学中探索蛋白质相互作用网络的重要手段。
2020-11-25 上传
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