莱茵衣藻启动子功能检测系统构建及应用

"一种莱茵衣藻启动子功能检测系统的构建 (2012年)" 这篇2012年的论文主要介绍了在莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中构建一个用于检测微藻启动子功能的生物系统。研究人员选择了莱茵衣藻作为实验模型，因为它是一种广泛研究的单细胞绿藻，常用于光合作用和生物能源相关的研究。在这个系统中，他们以pSP124质粒为基础，设计了一个特殊的T载体，目的是评估不同启动子的活性。 启动子是基因表达的关键元件，它控制着基因转录的起始位置。在本研究中，研究人员选取了雨生红球藻β-胡萝卜素酮化酶基因bkt1的启动子片段（长度为450 base pair，记为450 bp）作为间隔序列。为了方便操作，他们在该启动子片段两侧引入了两个Eam 1105 I限制性内切酶位点，这样可以方便地插入和提取不同的启动子片段进行功能测试。 利用聚合酶链式反应(PCR)技术，他们获取了bkt1启动子的1986 bp片段，并将其克隆到构建好的T载体上。接着，采用“珠磨法”将这个改造后的质粒导入莱茵衣藻CC-849的细胞中。这是一种非转化方法，通过物理破碎细胞壁，使外源DNA能够进入细胞。 转化后，通过筛选标记基因Zeo^R，研究人员成功获得了TranB-O.45和TranBle两个转基因藻株，表明1986 bp的bkt1启动子片段已成功整合并驱动了抗性基因的表达。然而，没有发现含有完整1986 bp bkt1启动子的转化子，这可能是因为该启动子片段中包含有负调控元件，阻碍了转化过程。 PCR分析证实，ble基因在转基因藻中稳定存在，表明bkt1启动子的450 bp片段确实具有启动子活性，能够有效地启动并表达BLE蛋白。BLE蛋白是一种抗生素抗性蛋白，它的表达是启动子功能有效的标志。 这项研究的结果表明，莱茵衣藻和pB-O.45 T载体构建的系统可以作为一种有效的方法来研究藻类启动子的功能，为微藻基因表达调控的研究提供了新的工具和策略。这种方法对于理解和优化微藻中的代谢途径，特别是在生物燃料生产和其他生物技术应用方面具有潜在价值。