Cell Genomics2,100096,2022年2月9日
3
基于NLA-III限制性内切酶的技术可以精确定量每个单细胞的
CNV谱。例如,我们观察到多个独特的CNV影响染色体18,这
不能通过批量WGS检测到(图2D;例如,拷贝数状态2、6和
11).与单细胞NLA-III测序平行,我们在
体外
进化的第一天和最
后一天进行了标准批量WGS。在这些批量数据中,我们在实验
结束时在重复1中观察到完整的D4然而,B等位基因频率
(BAF)显示两种等位基因仍然存在,尽管数量不等(图
S5)。这表明一部分细胞丢失了4号染色体的一个等位基因,其
余细胞丢失了另一个等位基因。为了在单细胞中证实这一点,我
们首先获得了4号染色体的二倍型,该二倍型是基于来自同一供
体的另一个类器官系,该供体完全丢失了4号染色体的一个等位
基因。然后使用该二倍型来评估每个单细胞中4号染色体的哪个
等位基因(如果有的话)丢失。事实上,在重复1中,我们观察
到314个单细胞具有D4等位基因A,96个细胞具有D4等位基因
B.也可获得18号染色体的双倍型。在这里,我们观察到18号染
色体上的所有独特缺失都涉及相同的等位基因。观察到的4号和
18号染色体的单细胞BAF是三峰的,峰值在0、0.5和1附近,表
明细胞是二倍体而不是四倍体(图S5B)。这些观察结果表明,
单细胞NLA-III测序和WGS的组合允许在单细胞中进行等位基因
特异性CNV检测。在类器官培养物中观察到的大多数缺失和扩增
也经常在CRC患者中观察到,这强调了类器官模型与研究结直
肠癌的相关性(图2C)。
我们总共在1,641个单细胞中鉴定了25个独特的CNV,具有
52个独特的CNV状态(我们将CNV状态定义为由至少两个单细
胞共享的全基因组CNV谱;STAR方法),大小范围从434个细胞
到3个细胞(图2D)。在重复1中,我们观察到具有D4和D18的
细胞的大量扩增,而在第二(重复2)和第三(重复3)实验中,
我们观察到具有D8p的细胞的扩增
图1. 实验装置
使用基于CRISPR-Cas9的策略转化野生型人结肠直肠类器官。用引入谱系条
形码的慢病毒文库转导
22
个
转化的类器官。类器官经历了26周的
体外
进化期,
在此期间,定期进行单细胞WGS,每周评估培养复杂性。从单细胞WGS,获
得拷贝数状态、sSNV状态和谱系条形码,从而允许构建和验证高度详细的克
隆进化树。
再乘以2对中位数归一化均值使用主成分分析的离散性降低表
明,细胞通过重复和时间点聚集,而对于早期时间点,各种重复
的细胞更相似(图S3)。不同拷贝数区域之间的重复断裂点通
过分层聚类然后循环二进制分割(STAR方法)检测。的高分辨
率和低噪声(图S4)
高分辨率克隆进化树
为了构建基于CNV的初始克隆进化树,我们使用CNV状态来创
建有向编辑距离图。由于相同的CNV状态可能存在于多个时间
点,因此将每个时间点添加为图中的单独节点。这使得能够实施
时间一致性(即,较早的时间点不能从较晚的时间点导出)。用
Edmonds算法从有向CNV编辑距离图中生成生成树形图. 使用
ToverBoom可视化克隆进化树(图3C所得到的克隆进化树指示
肿瘤沿着其进化的最可能的例如,复制1的树指示CNV状态3是
CNV状态2的后代,考虑到CNV状态2具有D18并且CNV状态3具
有D18和D4,这是合乎逻辑的(图2D)。总之,高分辨率CNV
调用允许构建具有时间分量的详细克隆进化树。