第
39
卷第
11
期
2011
年
11
月
东北林业大学学报
JOURNAL
OF
NORTHEAST FORESTRY UNIVERSITY
Vo
l. 39
No.
11
Nov.
2011
基于线粒体
COI
基因部分序列分析
4
种松毛虫的亲缘关系
1)
贾玉迪孔祥波张真王鸿斌
王风云张生
(河北省平泉县林业局)
(国家林业局森林保护学重点实验室(中间林业科学研究院森林生态环境与保护研究所)
.北京,
1
制
91
)
摘 要
为了探讨
4
种松毛虫的亲缘关系,对马尾松毛虫、油松毛虫、赤松毛虫和落叶松毛虫的线粒休
COJ
基
因序列进行了扩增和现
11
序。在获得的
636
峙的
COI
序列中成基的平均频率为
;A=34.75%
,
T/U
=34.759
奋,
C=15.25%
,
G=15.25%
。马尾松毛!k遗传多样性最高(核酸多样度为
3.93%)
,落叶松毛女最低
(0.629%)
0
4
种松毛虫间的
亲缘关系由远到近依次为:落叶松毛虫
x
赤松毛虫
(0.083)
、落叶松毛虫
x
马尾松毛虫
(0.068)
、落叶松毛虫
xì
由松毛
虫
(0.066)
、赤松毛虫
X)'
由松毛虫
(0.057)
、马尾松毛虫
x
赤松毛虫
(0.054)
、马尾松毛虫
xì'
由松毛虫
(0.012
)。基于
线粒体
COI
基因序列能够鉴别
4
种松毛虫之间伪亲缘关系,可作为种上的分子分类标记应用于松毛虫属昆虫系统
发育的研究。
关键词
马尾松毛
;k;
油松毛虫;赤松毛虫;落叶松毛虫
;COI;
亲缘关系
分类号
S763.
421;
Q9
63
Taxonomic
Position
of
Four
Species
of
Pi
ne
Caterpillar
Moths
ßased
on
Sequences Analysis
of
COI
Gene/Jia
Yudi.
Kong
Xiangbo, Zhang Zhen , Wang Hongbin (Key Laboratory of F orest Protection , State Forestry Administration
(R
臼
earch
Institute of Forest Ecology , Environment and Protection , Chinese Academy of
Fores
tI
γ)
, Beijing 100091 , P. R.
China);
Wang Fengyun , Zhang Sheng( Pingquan
ForestrγBureau
of Hebei
Province)//Joumal
of Northeast Forestry University.-
2011
,
39(11).
-67
-70
,78
Genetic differentiation among four species of
Dendrolimus
punc
的阳
,
D.
tabula
电
fomäs
,
D.
spec
时邸,
and
D.
super-
ans was analyzed based
on
COI gene sequences in order to clarify the taxonomic status of the four pine moths. The average
base frequencies of 636bp
COI gene sequences were obtained as A 34.
759
告,
T/U
34.759
岛,
C
15.25%
, and G
15.250
毛.
D.
punctat
ωhas
the highest genetic diversity
(3.93%)
, while the genetic diversity
of
D.
s
ψ
erans
is the lowest (0.
6290
毛)
•
'Th
e genetic distance among the four spices is in the order of
D.
Sl
ψ
erans
x
D.
spect
瓦
Lbilis
(0.
083)
,
D.
superans x
D.
punct
ωω
(0.068)
,
D.
s
叩
erans
x
D.
tabulaeformis
(0.066)
,
D.
spec
时
ilis
x
D.
时
ula
扩
ò
mLÍS
(0.057) ,
D.
punct
,
ωωX
D.
spectabilis
(0.054)
, and
D.
punctat
ωx
D.
tab
l1
1
0Æ!
formis
(0.012).
The COI
se
甲
ence
can be used
to
identify the
ge-
netic relationship between the four species of pine months and is a suitable marker in Dendrolimus molecular taxonomy.
Keywords
Dendrolimus
punctat
ω
;
D.
t
α
bula
矿
òrmis;
D.
spect
α
bilis;
D.
superans; COI; Genetic relationship
松毛虫属
(
Dendrolim
l1S
)
昆虫全世界共有
30
余种,分布在
中国的有
27
种,是重要的针叶林食叶害虫;部分松毛虫经常
大面积爆发成灾,影响林木生长。其中具有代表性的松毛虫
种类主要有马尾松毛虫
(
Dendrolimus
punctatl
且)、赤松毛虫
(D.
spectabilis)
、油松毛虫
(D.
tabula
吃
formis
)
和落叶松毛虫
(ρ'.
superans) [ 1
J
。为了研究这
4
种松毛虫之间的亲缘关系,
!:J
内学者进行了杂交遗传实验,结果表明,马尾松毛虫和油松
毛虫最容易进行杂交,油松毛虫和赤松毛虫次之,马尾松毛虫
和赤松毛虫交配率最低
[2-4]
。以上
3
种松毛虫正反杂交均可
进行,并产生具生育力的
Fl
代,不存在生殖隔离;但这
3
种松
毛虫与落叶松毛虫杂交的交配率很低,
FI
代死亡率高,存在
种间生殖隔离现象
[2-4]
。种间杂交是判断物种亲缘关系直接
有效的方法,但易受环境的制约,如发生期不一致,生活的温
度不同等。近年来,许多学者致力于利用分子生物学方法
(包括
HAPD[5-6J
、
ISSR[7
J
和等位酶
[8-9J
)研究松毛虫种间亲缘
关系和遗传分化,但几种分子标记得出的结论存在差异。目
前,线粒体
DNA
由于结构简单、母系遗传、单拷贝、进化速率
1)
中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金(
CAF-
R
If'
EE
P2
01
∞
2)
;国家自然同学基金项目
(30771737)
。
第一作者简介:贸玉迎,另,
1986
年
9
月,网家休业局森林保护学
重点实验室(中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所)
,硕
士研究生。
通信作者:孔祥波,国家林业局森林保护学主点实验室(中国林
业科学研究院森林生态环境与保护研究所)
,副研究员。
E-mail;
kongxbo@
hotrríaj
J.
eom
。
收稿日期
:2011
年
5
月
17
日。
责任编辑:程红。
较核
DNA
快等特点而被作为分子标记已广泛应用于昆虫系
统学的研究中[
IOJ
。其中细胞色素氧化酶
I
序列( mtDNA-
CO
I)
被证实可以作为条形码用于鳞翅目昆虫分类系统研
究
[1
山],因此,本研究采用
COI
基因作为分子标记研究这
4
种松毛虫的亲缘关系,对该基因在松毛虫属亲缘关系研究中
的应用进行可行性论证。
1
材料与方法
1.
1
材料
试验材料均为
2
∞
9
年
4
月至
2010
年
10
月采集的松毛
虫活茧,茧羽化出成虫后进行种类鉴定并用无水乙醇浸泡脱
水,置于
-20
'c保存备用。考虑到马尾松毛虫的分布范围广,
所以取样点最多,其他几种松毛虫根据分布区域的大小确定
取样点数量。松毛虫的采集信息见表
10
1.
2
DNA
提取、扩增及测序
采用
DNA
提取试剂盒(
QIAGEN
公司)进行
DNA
提取。
扩增所用引物和条件参照
Hebert
的方法
i16]
,引物为
:LEP-F
,
5'-
ATTCAACCAATCATAAAGATATfGG-
3';
LEP - R ,
5'
-TA-
AACTfCTGGATGTCCAAAAAATCA -
3'
。扩增条件
;94
'c预变
性
1
min
;94
'c变性
1
min ,45
'c复性
1
min 30 s , 72
'c延伸
I
min
15
s
佳运行
6
个循环,接下的
36
个循环
94
'c预变性
1
min;
51
'c复性
1
min
305;72
'c延伸
lminl5s
,完成后
72
'C延伸
5
mino
以
ddH
2
0
代替模板作空白对照。
PCH
产物用
1.0%
琼
脂糖凝胶电泳进衍检测,合格后回收纯化,并用
Erkin
Elmer
3100
型测序仪进衍正反双向测序。引物合成和测序由华大
基因生物工程有限公司完成。