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采用重叠延伸 PCR 获得植物密码子优化的奶牛 α 干
扰素基因
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王雅楠,汪明*
中国农业大学动物医学院,北京 (100094)
E-mail:cauwangyn@gmail.com
摘 要:根据 Genbank 中荷斯坦奶牛基因的氨基酸序列,按照紫花苜蓿密码子偏爱性,人工
设计并合成了 14 条寡核苷酸片断,通过重叠延伸 PCR 并结合定点突变 PCR 人工合成植物密
码子偏爱性的荷斯坦奶牛 α 干扰素基因序列。经克隆测序,证明成功地合成了奶牛 α 干扰素
基因。
关键词:牛干扰素,重叠延伸 PCR,定点突变 PCR
中图分类号:S8
1.引言
干扰素( Interferon , IFN) 是在特定的抗原刺激下由细胞分泌的一类具有抗病毒、抗肿瘤
和免疫调节功能等生物活性的糖蛋白。其只能在诱导剂刺激下产生,因而采用基因工程的手
段获得干扰素是一个最佳的选择。牛干扰素国内外从 80 年代开始就展开研究[1],已经在多
种系统中获得表达
[2.3]
,但是尚未有在植物中表达的报道。
重叠延伸 PCR 技术(gene splicing by overlap extension PCR, gene SOEing), 简称 SOE
PCR,使用了具有互补末端的引物使 PCR 产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通
过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来,广泛用于构建突变基因、融合基因、
长片段基因的合成、基因敲除、基因的体外分子进化和扩增目的基因
[4]
。本文采用重叠延伸
PCR 首先获得了缺失一个碱基的按照紫花苜密码子偏爱性改造后的荷斯坦奶牛 α 干扰素
(Bovine Interferon-α,BoIFNα),再采用 SOE PCR 诱变,插入了缺失碱基,获得了预期的
序列,希望该基因可以在植物中获得高表达量。
2.材料和方法
2.1 菌株、质粒、工具酶及主要试剂
大肠杆菌 DH5α、载体 pGEX6p-1,均由本实验室保存。限制性内切酶购自中晶公司。
卡那霉素,氨苄霉素购自欣经科公司。连接酶,PyrobestTM DNA 聚合酶,dNTP 等购自宝
生物工程有限公司,胶回收纯化试剂盒、质粒抽提试剂盒购自全式金生物技术公司。寡聚核
苷酸片段由上海生工生物技术有限公司合成,并经 PAGE 纯化。基因测序由北京百泰克生
物技术有限公司完成。
2.2 方法
2.2.1 密码子优化
采用生物学软件 DNAman 分析 BoIFNα 基因序列(GenBank 序列号为 M10952),以
CUTG(Codon Usage Tabulated from GenBank,www.kazusa.or.jp/codon)所提供的紫花苜蓿
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本课题得到 2003 年度高等学校博士学科点专项科研基金(项目编号 20030019019)的资助。
*通讯作者