cDNA末端快速扩增技术(RACE)原理与应用

"本文介绍了RACE原理，包括3' RACE和5' RACE技术，以及它们在克隆基因中的应用。RACE技术是一种基于PCR的快速扩增cDNA两端的技术，适用于从低丰度转录本中获取完整基因序列。" RACE（cDNA末端快速扩增）技术是分子生物学中一种常用的方法，它允许研究人员从已知的部分cDNA序列出发，获取基因的5'和3'末端完整序列。这项技术自1988年由Frohman等人提出以来，经历了多次改进，以提高其效率和特异性。 5' RACE和3' RACE是RACE技术的两个关键组成部分。5' RACE主要用于确定mRNA分子的非编码区，例如启动子序列，而3' RACE则用于获取包含poly(A)尾巴的编码区末端。传统的RACE技术通常涉及反向转录（RT-PCR）过程，使用oligo(dT)引物合成cDNA的第一链，然后进行PCR扩增。 为了优化RACE技术，研究者引入了多种改进策略。例如，使用锁定引物，即在oligo(dT)引物3'端添加简并核苷酸，可以更精确地定位在poly(A)尾的起始点，减少不准确结合的可能性。另外，5'端加尾时使用poly(C)代替poly(A)，可以避免二级结构对逆转录的干扰。此外，选择能耐受较高温度的RNase H-莫洛尼氏鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶或嗜热DNA聚合酶，可以更有效地在高温下进行逆转录，降低二级结构对反应的影响。最后，采用热启动PCR和降落PCR技术进一步提高了PCR反应的特异性，减少了非特异性扩增。 随着技术的发展，商业化RACE试剂盒如CLONTECH的MarathonTM技术和SMARTTM RACE技术应运而生，为科研人员提供了更为便捷的解决方案。这些工具简化了实验步骤，提高了实验的成功率，使得RACE技术在基因克隆和功能研究中发挥了重要作用。 RACE原理是分子生物学中一个重要的技术，通过不断的技术革新，它已成为克隆和分析基因5'和3'末端序列的重要手段。无论是学术研究还是工业应用，RACE技术都极大地推动了我们对基因表达和功能的理解。