钩端螺旋体新表位刺激免疫应答：计算机分析和疫苗候选物研究

医学信息学解锁25（2021）100649博氏钩端螺旋体新的有效表位刺激体液和细胞介导的免疫应答：EX实验和理论研究Yada Tansiria，b，Tepyuda Sritrakul c，Patchreenart Saparpakorn d，TimpornBoondamnerna， e， Aunlika Chimprasitd，Sineenat Sripattanakule， f，SupaHannongbuad， f，Wuywan Praponge，a，f，g，*泰国曼谷Kasetsart大学农业和食品高级研究中心（CASAF），邮编：10900b泰国曼谷10520蒙固国王理工学院医学系cKasetsart大学兽医学院，Kamphaeng Sean校区，Nakhon Pathom，73140，泰国d泰国曼谷Kasetsart大学理学院化学系，邮编10900泰国曼谷Kasetsart大学兽医学院生理学系，邮编10900f泰国曼谷Kasetsart大学研究生院遗传工程跨学科研究生课程，邮编：10900g Wa l a i l a k 大 学Akkhraratchakumari兽医学院。222 Thaiburi，Thasala District，Nakhon Si Thammarat，80160，ThailandA R T I C L EI N FO保留字：分子对接分子动力学模拟表位MHCT细胞受体（TCR）钩端螺旋体疫苗A B S T R A C T由于rhKU_Sej_LRR_2271蛋白含有预测的免疫原性表位，因此将其作为钩端螺旋体疫苗候选物之一引入。在这项研究中，已经使用了计算机序列和基于结构的分析来分析该蛋白的MHC I类和II类限制性表位。采用Six表位预测程序，其中比对来自每个程序的具有高预测分数的表位。从至少两个预测程序中选择预测评分高于截止值的21个潜在不受限制的表位。通过三维分子模拟、分子对接和分子动力学模拟，研究了多肽-MHC复合物与T细胞受体的亲和结合。一个有希望的表位，即171- LLFLPLIKI，显示出与MHC I类和II类等位基因结合的效力。两种新设计的含有可结合超过3种MHC等位基因的表位的肽LL 17：171-LLFLPLIKILYVDRNKL-187和SL 19：209-SLNSGIKALPFNYEKLVNL-227， 显著 增加产生干扰素-γ（IFNg）的特异性T细胞再活化rhKU_Sej_LRR_2271免疫兔与未免疫兔相比，LL 17肽还可以在免疫的兔中诱导产生干扰素-γ的特异性CD 4+ T细胞应答为体液免疫应答的评价中，免疫兔的血浆中特异性IgG的量显著高于未免疫兔。使用流式细胞术在动物模型中进行的T细胞应答的离体研究证实了用于发现蛋白质的潜在T细胞表位的理论上的计算机模拟分析的完成。结果表明，rhKU_Sej_LRR_2271蛋白含有混杂的T细胞表位，可诱导体液免疫和细胞免疫应答，是一种有前景的钩体疫苗候选蛋白。1. 介绍钩端螺旋体病是由致病性钩端螺旋体引起的一种细菌性败血症性传染病，可在世界各地引起人和动物尤其是牲畜的疾病。该病是一种普遍存在的人畜共患病，与慢性感染的带菌者动物有关。钩端螺旋体可通过直接接触受感染的动物传播，也可通过间接接触污染的受感染动物的尿液污染了水和土壤致病性钩端螺旋体已被鉴定为超过260种免疫学上不同的血清型[1]。在这些致病性物种中，波氏钩端螺旋体血清型Sejroe是在泰国引起牛感染的重要血清型[2]。利用生物信息学技术和动物模型的实验研究，开展了预防动物钩端螺旋体感染的疫苗研究为了研制有效的疫苗，* 通讯作者。瓦莱拉克大学Akkhraratchakumari兽医学院222 Thaiburi，Thasala，Nakhon Si Thammarat，80160，Thailand.电子邮件地址：fvetsrp@yahoo.co.th，siriwan. wu.ac.th（S.Prapong）。https://doi.org/10.1016/j.imu.2021.100649接收日期：2021年3月22日;接收日期：2021年6月21日;接受日期：2021年在线预订2021年2352-9148/© 2021作者。出版社：Elsevier Ltd这是CC BY许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表医学信息学期刊主页：www.elsevier.com/locate/imuY. Tansiri等人医学信息学解锁25（2021）1006492必须清楚地揭示在细胞介导的和人免疫应答中针对钩端螺旋体的保护性免疫。用L.牛的Borgpetersenii serovar Hardjo。 它可以刺激显著水平的产生干扰素-γ（IFNg）的细胞和显著数量的产生IFNg的CD 4+ T细胞，预防针这些结果显示了在接种疫苗后诱导持续的1型辅助性T细胞介导的免疫应答的重要发现[3]。本研究旨在通过计算生物信息学、免疫原性预测程序和动物模型的离体实验，筛选出能够刺激钩端螺旋体病保护性免疫应答的免疫原性表位。我们已经鉴定并成功表达了来自L.红毛藓我们假设L. borgpeterseniirhKU_Sej_LRR_2271杂合蛋白可能是诱导有效免疫应答的潜在靶点，通过产生强烈的体液免疫应答和细胞介导的免疫应答（包括功能性CD4+和CD8+ T细胞应答）来治疗钩端螺旋体病。为了验证这一假设，我们进行了计算机模拟分析，以基于肽与主要组织相容性复合物（MHC）I类和II类分子的结合亲和力以及T细胞对肽-MHC（pMHC）的识别来通过六个在线程序鉴定T细胞表位，并且将来自这些程序的每个表位的结合评分全部比对。从至少两个软件中选择预测评分高于截止值的无限制表位为了评估T细胞受体（TCR）对pMHC复合物的识别，使用了具有3D建模的计算分析[5，6]、分子对接（MD）[7，8]和分子动力学模拟（MDS）[9]。预测结果揭示了可能与数据库中常见HLA等位基因结合的混杂表位。对于T细胞应答的测量，使用含有表位的肽。设计并合成了由MD和MDS评价预测的主题。基于与至少三个MHC等位基因结合的MHC标准选择这些肽。通过使用流式细胞术测量细胞内产生干扰素-γ（IFN-γ）的T细胞，评价rhKU_Sej_LRR_2271蛋白免疫家兔的离体T细胞应答。此外，通过测定免疫家兔血浆中特异性IgG来评价体液免疫应答。这些结果有力地表明，基于计算机的计算机模拟研究和基于结构的分析的生物信息学工具可以用于发现可以诱导强烈免疫应答的潜在混杂T细胞表位。结果表明，rhKU_Sej_LRR_2271蛋白预测的抗原表位能有效地诱导免疫家兔产生体液免疫和细胞免疫应答，可用于疫苗的研制。本研究显示了将计算分析和动物模型的离体实验相结合用于钩体疫苗开发的优势。2. 方法2.1. 通过计算机模拟分析预测T细胞表位通过MHC结合预测程序从rhKU_Sej_LRR_2271富含亮氨酸的重复蛋白中鉴定T细胞表位。氨基酸序列从NCBI数据库获得（GenBank登录号JX522460）。结合MHC II类分子的表位的预测使用基于SYFPEGII的基序矩阵、附加方法MHCP red [10]、基于NetMHCII 2.2的人工神经元网络和基于Propred的定量矩阵[11]进行。为了预测与MHC I类分子结合的表位，将蛋白质序列进行基于Propred I的基质[12]，人工免疫印迹法和免疫印迹法。基于NetMHC 3.4 [13]、SYFPEGRENT I和MHCP red的神经元网络。根据数据库中鉴定的最常见的MHC等位基因[14，15]，随后评估表位与MHC II类等位基因的结合亲和力，所述MHC II类等位基因包括HLA-DRB 1 *0101、HLA-DRB 1 *0301、HLA-DRB 1 *0401、HLA-DRB 1 *0701、HLA-DRB 1 *1101和HLA-DRB 1 * 0401。HLA-DRB 1 *1501和包括HLA-A*0201的MHC I类等位基因。用于选择候选表位的可接受的标准如下：1）基于先前文献，将高于阈值的评分分级对于SYFPEG1 [ 16 ]，定义得分> 25的特征和程序指令，对于Propred，定义阈值> 3%。结合亲和力小于50 nM表示为强结合亲和力，50-500nM表示为弱结合亲和力。 nM表示为对NetMHC II 2.2、NetMHC 3.4和MHCP red的弱结合亲和力。2)选择通过标准1）至少两种方法的表位进行进一步研究。为了确认这些表位的存在，使用先前鉴定的来自钩端螺旋体已知抗原蛋白（包括LipL 32、LigA和OmpL 1）的表位进行基于序列的表位预测[172.2. MHC分子T细胞表位预测及T细胞受体识别的2.2.1. 基于MHC结构的肽表位的制备预测表位的3D结构是根据LBJ_2271的同源模型和先前研究中发表的rhKU_-Sej_LRR_2271的全蛋白结构构建的[4，23]。比对肽序列，并从蛋白质结构建模中检索短肽结构。使用LBJ_2271蛋白的同源性模型作为模板 结 构 ， 通 过 Discovery Studio （ DS ） 3.0 中 的 Modeler 9v8 构 建rhKU_Sej_LRR_2271蛋白的表位在侧链优化程序DS 3.0中对肽侧链的构象进行了优化.从蛋白质数据库（PDB）获得MHC分子的PDB结构，其排除了原始结合肽。PDB标识号DRB*0101、DRB*0301、DRB*0401、DRB*1501和A*0201等位基因分别为1SJE、1A6A、2SEB、1BX 2和1AO7。DRB*0701和DRB*1101等位基因的结构在数据库中不可用。因此，通过同源性建模构建三级结构。从免疫多态性数据库（IPD）获得DRB*0701和DRB*1101等位基因的氨基酸序列。将序列进行Swiss模型模板鉴定工具，并与模板结构的氨基酸序列进行比对。在DS 3.0中进行同源性建模，并在Swiss模型结构评估中验证模型结构2.2.2. 肽在MHC I类和II类分子上的分子对接以及T细胞受体（TCR）在肽-MHC复合物上的利用分子对接技术研究了特异性肽与MHC I类或II类分子的相互作用以及TCR与肽-MHC复合物（pMHC）的对接。将预测的表位与MHC I类和II类分子对接，然后使用DS 3.0客户端中的对接蛋白方案将TCR分子对接到pMHC复合物上。ZDOCK是一种基于网格的全局搜索算法，用作快速傅立叶变换技术和一种新的形状互补评分函数。RDOCK是一种基于CHARMM力场能量最小化方案的算法，用于消除范德华碰撞并优化极性和电荷的相互作用。评分系统由CHARMM静电能项和去溶剂化能项组成[7，8]。首先，我们利用ZDOCK将一个多肽与MHC分子对接。界面残基的距离限制保持在10 μ m，配体取向旋转采样的角度步长为15 μ m。认为构象与原始PDB结构相似。对接肽在MHC结合沟上的取向应与天然结构相似。然后，使用RDOCK协议进一步细化所选择的停靠位姿。具有最低RDOCK分数和最高ZDOCK分数的每个姿势Y. Tansiri等人医学信息学解锁25（2021）1006493×保留pMHC复合物用于进一步与TCR对接。pMHC复合物在TCR上的对接与在pMHC对接中同样进行。从PDB数据库中检索两个PDB分子，用于T细胞CD8+ T细胞（PDB ID：1AO7）和CD4+ T细胞（PDBID：2IAM）。对接复合物的构象应类似于 肽与TCR α和β链相互作用的天然结构。测定了ZDOCK评分、RDOCK评分和受体与配体之间的氢键，用于对接复合物的比较分析。2.2.3. 分子动力学模拟分子动力学（MD）模拟是动态研究生物分子相互作用的标准工具。模拟有助于理解生物化学过程，并为结构数据提供动态维度[9]。通过模拟研究分析了TCR/pMHC复合物的特性。使用GROMAC 2021.1版程序中的CHARMM 27力场进行模拟[24]。肽-MHC复合物和TCR的对接复合物形成被用作初始结构。用TIP3P水模型对该体系进行了溶剂化。为了中和该体系，向体系中加入氯离子和钠离子。使用最陡下降最小化算法进行50000步，步长为0.01 ns的能量最小化，以去除不良接触并放松系统。系统的平衡步骤分别用NVT和NPT系综进行。对于NVT和NPT平衡步骤，该结构在300 K下平衡100 ps，步长为2 fs。所有MD模拟在300 K和1 bar下进行50 ns，步长为2 fs。2.3. 动物新西兰白兔购自泰国Mahidol大学国家实验室动物中心。保存在泰国Kasetsart大学兽医学院本研究中使用的所有家兔均为雌性，年龄匹配，为10实验组（免疫组）和阴性对照组各3只将每只家兔单独饲养在标准笼中，可自由采食市售颗粒饲料和饮用水。动物实验方案由Kasetsart University Institutional Animal Care and Use Committee（Kasetsart University-IACUC）批准2.4. 重组KU_Sej_LRR_2271蛋白rhKU_Sej_LRR_2271蛋白质如前所述在大肠杆菌BL 21 Star™（DE3）表达系统中由pET 160_h-KU_R21_2271质粒产生[4]。简言之，从pET160_hKU_R21_2271转化的E. coli BL 21 Star ™（DE 3）中，加入异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）。收集细胞沉淀并通过超声处理破碎。 总细胞裂解物为12000离心g，4℃，20 不溶性蛋白质是收集并用LEW缓冲液洗涤两次，然后重悬于变性增溶缓冲液（DS：50mMNaH2PO4，300mMNaCl，8M尿素，pH 8.8）的混合物（SigmaFast™蛋白酶抑制剂混合物片剂，Sigma-Aldrich™）。溶解和溶解的蛋白质通过固定化金属离子亲和色谱（IMAC）技术用Protino® Ni-TED树脂（Macherey-Nagel，德国）纯化。将纯化的蛋白质保存在-20°C直到使用。2.5. 免疫方案将rhKU_Sej_LRR_2271重组蛋白与完全弗氏佐剂的混合物500μg皮下注射于新西兰白兔（n=次免疫对于第二次和第三次免疫，分别用重组蛋白和不完全弗氏佐剂的混合物肌肉内和皮下施用。第二次免疫在第一次免疫后14天，第三次免疫在第二次免疫后28天。阴性对照组3只，用磷酸盐缓冲液与佐剂混合液免疫，免疫程序与疫苗疗程相同。分别于第1次免疫后0、14、28、56天采集全血标本，分离外周血单个核细胞（PBMC）和血浆。新鲜制备的PBMC用于使用流式细胞术评估特异性T细胞功能等离子体收集并保存在-80°C直至使用。2.6. 外周血单核细胞（PBMC）分离从中央动脉抽取全血（8 ml）至EDTA管中。在四个时间点收集全血以评价T细胞应答，所述时间点包括作为基线的第一次免疫前、第一次免疫后14天、第二次免疫后14天和第三次免疫后14天。使用Ficoll-Hypaque试剂（Amersham）通过梯度离心分离PBMCs。将分离的PBMC用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤，然后重悬于R10培养基（补充有10%胎牛血清; FBS、青霉素/链霉素和HEPES），浓度为106个细胞/ml[25，26]，用于测量特异性T细胞应答。2.7. 通过流式细胞术测量特异性T细胞应答新鲜制备的PBMC用于通过使用流式细胞仪测量细胞内IFNg产生来流式细胞术[25，26]。简而言之，对于产生IFN g的T细胞的测量，在37 ° C、5%CO2下，在含有蛋白质转运抑制剂（莫能菌素，BectonDickinson）的R10培养基中，用浓度为10 μ g/ml的单个肽刺激106个PBMC 6 小 时 。 合 成 所 有 肽 并 HPLC 纯 化 至 90%-95% 的 纯 度（Mimotope，Australia）。植物血凝素（PHA，Sigma-Aldrich）和R10培养基分别用作阳性和阴性对照。对于细胞表面染色，用APC缀合的小鼠抗兔CD 4（克隆KEN-4，Abcam）和FITC缀合的小鼠抗兔CD 8（克隆12.C7，Serotec）在含有1%FBS的PBS中，和0.1%叠氮化钠（FACS缓冲液）在4 ℃下孵育45 min随后，细胞使用CYTOFIX/Cytoperm溶液（Becton Dickinson）在4℃下透化40分钟。对于细胞内染色，在CYTOFIX/Cytoperm洗涤缓冲液中用PE缀合的小鼠抗牛IFNg（克隆CC 302，Serotec）在37℃下将透化细胞染色30分钟。 最后将染色的细胞固定在1%多聚甲醛（Sigma-Aldrich）溶液中，并通过流式细胞术（CytoFlex，Beckman Coulter）获得至少500，000个细胞。本研究中的所有抗体在抗体滴定和适当进行补偿控制后以最佳浓度使用。对于IFNg产生的测量，使用同种型对照作为对照。从阴性对照中减去用肽刺激的特异性T细胞应答，仅将高于其背景水平的T细胞应答视为阳性值。2.8. 用ELISA法评价特异性体液免疫应答通过酶联免疫吸附试验（ELISA）评价免疫组和对照组兔中抗rhKU_Sej_LRR_2271蛋白的体液特异性IgG。简言之，将碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液（CBB）中的rhKU_- Sej_LRR_2271蛋白（7.5μg/ml）包被在96孔板（100μl/孔）上，在室温下孵育2 h，然后用添加吐温的1X PBS（PBST）洗涤3次。加入300μ l含2%BSA的PBSTY. Tansiri等人医学信息学解锁25（2021）1006494并在室温下孵育1小时。然后，加入100μl 1：1600稀释的兔血浆或PBS，并在37 ℃下孵育10分钟。1小时之后，加入2.7%过氧化氢并孵育5分钟。洗涤步骤后，将稀释至1：20000的山羊抗兔将100μ l的1-Step™Ultra TMB-ELISA sub-ELISA随后加入底物溶液（Thermo Scientific）并在黑暗中孵育5分钟。然后，向每个孔中加入2M硫酸。通过ELISA读数器（Biotek仪器公司，USA）在450 nm处。从样品的光密度（OD）中减去背景的光密度（OD）2.9. 统计分析使用Student t检验进行统计学分析，以比较对照和免疫兔之间的抗体产生水平。使用单因素ANOVA（Krusskal-Wallis检验）来比较产生IFN g的T细胞的频率。数据计算为中位值。小于0.05的p值被认为具有统计学显著性。3. 结果3.1. T细胞表位基于序列的方法最初用于从rhKU_Sej_LRR_2271蛋白中筛选T细胞表位。利用SIX在线表位预测程序来预测T细胞表位。为了预测与MHCII类分子结合的表位，针对六个HLA-DRB等位基因分析序列来自NetMHCII 2.2 、 SYFPEGII I 和MHCP red 的结 果显示 ，与HLA-DRB*0101等位基因结合的表位具有最高的结合亲和力评分，分别为3.7、36和0.78。在NetMHCII2.2和MHCP red中，与该HLA等位基因结合的表位的数量高于其他HLA-DRB等位基因（表1）。如表2所示，将来自Propred程序的每个等位基因的表位的最高预测分数与已知钩端螺旋 体 抗 原 蛋 白 LipL32 、 LigA 和 OmpL1 的 表 位 预 测 分 数rhKU_SEJ_LRR_2271评分与已知抗原蛋白具有相当的评价值。重要的是，与HLA-A*0201和HLA-DRB *1501等位基因结合的预测表位的Propred评分高于LipL 32和LigA预测评分，同时等于OmpL 1的最高评分（表2）。为了评价其他潜在有效的T细胞表位，进行了来自每个表位的预测评分与来自每个程序的截止值以上的从至少2个预测程序中选择预测评分高于阈值的21个表位，并将其分类为：如表3（3.1和3.2）所示，它们被定义为有效的T细胞表位。有趣的是，在氨 基酸位置171-LLFLPLIKI的表位能够结合MHC I 类（A*0201）和MHC II类（DRB 0 *101，表1通过生物信息学程序对rhKU_Sej_LRR_2271蛋白的表位预测揭示了预测评分高于截止值的表位数量。等位基因SYFPEG1 MHCPred NetMHC PropredA b a b a b a b表2比较来自rhKU_Sej_LRR_2271蛋白的表位与来自已知抗原性钩端螺旋体蛋白的表位之间每个MHC等位基因的最高Propred预测评分。MHC等位基因Propred预测得分hKU_Sej_LRR_2271LipL32LigaOMPL1A*02016.15.54.36.1DRB*01011.73.32.61.1DRB*03014.84.45.24.8DRB*04013.83.95.03.8DRB*07016.55.57.06.5DRB*11014.44.53.04.4DRB*15015.75.55.55.7DRB*0301、DRB*0701、DRB*1101和DRB*1501）等位基因。3.2. 预测的T细胞表位与MHC分子的对接和模拟及TCR对pMHC复合物的识别为了进行MHC结合肽的结构分析，使用了MHC结合肽的3D结构。基于LBJ_2271和rhKU_Sej_LRR_2271杂合蛋白的同源性模型生成了21个预测的T细胞表位[4，23]。HLA-DRB*0701和DRB*1101等位基因的氨基酸序列分别从IMGT/HLA获得，登录号为HLA 00719和HLA 00751。用于HLA-DRB*0701等位基因的模板是PDB id：1 SEB，人MHC II类糖蛋白HLA-DR 1和细菌超抗原的复合物，具有89.0%的序列同一性，而用于HLA-DRB*1101等位基因的模板是PDB id：1A 6A，MHC II类成熟中的中间体的结构：CLIP结合到HLA-DR 3，具有94.2%的序列同一性。在通过序列分析预测MHC I类和II类结合表位之后，使用基于结构的分析来确认21个所选肽作为T细胞表位的预测所选的dock具有与MHC分子的原始PDB结构相似的结构取向。结合沟中肽的N-末端指向MHC I类分子中α结构域和MHC II类分子中α-β结构域的C-末端具有最佳得分的pMHC复合物进一步与TCR对接。表4中示出了具有高得分的7个pMHC/TCR复合物的对接得分和每个MHC等位基因中的氢键数目。“SLEELDLSL“肽显示与MHC I类等位基因的最高对接得分和氢键数（A*0201）。“ILYVDRNKL“肽在与MHCII类等位基因（DRB*0701）复合时表现出最高的对接得分和氢键数。图1显示了与MHC I类和II类分子形成的氢键数最多的pMHC/TCR复合物的结构。“SLEELDLSL“肽与MHCI类分子形成15个氢键，如图1A所示，而“ILYVDRNKL“肽与MHC II类分子之间形成10个氢键，如图1B所示。参与氢键相互作用的残基和距离见表5。在“ILYVDRNKL”肽上的残基1和3处存在2个氢键，并且在残基8处存在3个氢键。只有该肽的残基1与两者相互作用MHC和TCR分子。 “SLEELDLSL“肽具有15个氢原子，与MHC和TCR分子形成的键。在其他残基中，残基1和3具有最高数目的氢键（4个键）残基1、2和4与MHC和TCR分子相互作用，该肽的 第3段仅与MHC分子相互作用DRB*0101 8 36 108 0.78 58 3.70 11 1.70DRB*0301 5 29 n n 11 7.20 6 4.80DRB*0401 10 28 1 32.28 3 34.30 10 3.80为了研究复杂结构的柔性，为了验证预测表位的一致性，对肽/MHC/TCR复合物进行MD模拟。均方根偏差DRB*0701 5 30DRB*1101 0 255 10.40 16 4.30 12.50n n 38 6.60 12 4.40（RMSD），复杂结构的稳定性的指示，DRB*1501 6 34 n n 7 42.70 12 5.70电话：020 - 6666666传真：020 - 66666666a=预测表位的数量; b=最高预测评分。n=该等位基因不包括在预测程序中。报道了在生产阶段相对于起始结构的整个分子。对于SLEELDLSL/MHC I（A*0201）/TCR复合物，在35 ns后发现SLEELDLSL肽复合物中的骨架原子的低波动，RMSD值小于2 μ m，Y. Tansiri等人医学信息学解锁25（2021）1006495表3证明了来自rhKU_Sej_LRR_2271蛋白的预测T细胞表位，其预测评分高于至少2个预测程序的阈值用预测评分4预测程序报告了MHC I类（表3.1）和MHC II类（表3.2）等位基因的表位序列和位置表3.1/表3.2表位位置序列表3.1：来自每个预测程序的MHC I类等位基因（A*0201）的得分a/表3.2：来自每个预测程序的MHC II类等位基因（等位基因）的得分aPropred I/Propred MHCPred/MHCPred NetMHC3.4/NetMHCII2.2 SYFPEGII I/SYFPEGII I表3.1来自每个预测程序的MHC I类等位基因（A*0201）的表位位置序列评分a Propred IMHCP red NetMHC3.4SYFPEGRAM I94 KLSTVPEEV–4.78 19110 KLDLRLNSL166 ILPSELLFL–4.23 28–小行星1716.13–5.0224 27–202 SLEELDLSL72 27小行星209表3.2-3.90–来自每个预测程序的MHC II类等位基因（等位基因）的表位位置序列评分a PropredMHCP red NetMHCII2.2SYFPEGII25（DRB*1101）26（DRB*0401）aMHCP red和NetMHC中报告的结合评分为结合亲和力（nM）。Propred中报告的评分是log结合评分，而SYFPEG1报告为肽结合能力评分。示于图凌晨2从图中，骨架TCR链和SLEELDLSL肽的平均RMSD值在HLA-A*0201的情况下，所有链（α I，II和III）的RMSD显示与复合物类似的趋势。然而，作为结合部分的α I和II部分（残基1与肽结合并与TCR连接的RMSD相当低，其值为2.30 μ g，表明肽结合在模拟时间内稳定。然而，αIII部分（残基181-274）引起的高波动被 报 告 为与 β2 微 球 蛋 白结 合 的 部 分 。 对 于 ILYVDRNKL/MHC II（DRB*0701）/TCR复合物，来自50 ns模拟的RMSD结果示于图1B中。 2 B. 的53FLVIGFVCF5.5（DRB*0701）––25（DRB*0101）55VIGFVCFTA0.68（DRB*0101）––30（DRB*1501）5.1（DRB*1501）58FVCFTASFD0.78（DRB*0101）–30（DRB*1501）134LNLFGNDLT4.0（DRB*1501）––26（DRB*0401）28（DRB*1501）148公司简介1.8（DRB*0401）3.5（DRB*0101）3.7（DRB*0101）29（DRB*0101）28（DRB*0401）151LKNLKVLLA0.7（DRB*0101）––25（DRB*0101）3.0（DRB*0301）3.0（DRB*0401）4.4（DRB*1101）3.7（DRB*1501）154LKVLLAGNN–10.4（DRB*0701）–25（DRB*0101）164FTILPSELL1.7（DRB*0101）–4.6（DRB*0101）36（DRB*0101）2.5（DRB*0401）28（DRB*0401）5.6（DRB*0701）26（DRB*0701）171LLFLPLIKI1.0（DRB*0101）––26（DRB*0101）3.0（DRB*0301）4.9（DRB*0701）2.6（DRB*1101）4.7（DRB*1501）173FLPLIKILY3.5（DRB*1101）3.63（DRB*0101）–26179ILYVDRNKL5.4（DRB*0701）2.34（DRB*0101）–284.2（DRB*1501）26（DRB*0401）180LYVDRNKLT1.6（DRB*0401）––27181YVDRNKLTL1.9（DRB*1101）6.22（DRB*0101）194维拉斯0.9（DRB*0101）––333.8（DRB*0401）26（DRB*0401）3.8（DRB*1101）24（DRB*1501）219FNYEKLVNL0.4（DRB*0101）1.56（DRB*0101）–4.3（DRB*0701）227林克尔尼0.7（DRB*0101）3.92（DRB*0101）–263.4（DRB*0301）4.3（DRB*0701）3.9（DRB*1101）5.7（DRB*1501）Y. Tansiri等人医学信息学解锁25（2021）1006496表4表位肽与MHC分子和T细胞受体结合的分子对接。显示了具有最高对接分数和氢键的MHC等位基因和肽DRB*0101 VEILASLSS-13.226 9DRB*0301 LLFLPLIKI-14.965 7DRB*0401 LNLFGNDLT-13.934 6DRB*0701 ILYVDRNKL-17.200 10DRB*1101 LKNLKVLLA-9.996 8DRB*1501 LINLKRLNI-15.771 8结果表明，配合物的稳定性，沿模拟的平均RMSD为2.15 μ m。分离的链也显示了稳定性，平均RMSD值为1.85、1.94、2.17、2.17和2.18。对于DRB*0701 α、DRB*0701 β、ILYVDRNKL肽、TCR α和TCR β分别 为 1.72 μ gMD 结 果 表 明 ， SLEELDLSL/MHCI （ A*0201 ） 和ILYVDRNKL/MHCII （ DRB*0701） 复合物 与 TCR 有较 强的结 合。SLEELDLSL/MHCI/TCR和ILYVDRNKL/ MHCII/TCR复合物沿MD模拟在0、10、20、30、40和50 ns处的快照显示在图1中。3a和B，分别。3.3. 设计具有潜在混杂T细胞表位的肽选择来自rhKU_Sej_LRR_2271蛋白的T细胞表位，其具有高于来自至少2个预测程序的阈值的预测评分（表3.1和3.2），并且对于pMHC/TCR复合物的形成具有最高的分子对接评分（表4）。这些表位含有混杂的T细胞表位。如表6所示，设计了包括FN 15、LL 17、VL 17和SL 19的四种新肽。这些新设计的肽含有具有高预测分数的重叠表位，并且含有以最高对接分数（表4）结合各种MHC等位基因（表3.1和3.2）的能力。所有新设计的肽都被推荐为蛋白质的假设不受限制的T细胞表位。作为补充图1中所示的rhKU_Sej_LRR_2271蛋白的3D模型结构，以红色和黄色示出了包含MHC I类和II类限制性表位的预测表位的区域。红色表示LL17肽，黄色表示VL17和SL19肽。红色区域显示了位置171-187处的表位，其对MHC I类等位基因HLA-A*0201和MHC II类等位基因HLA-A* 0202具有特异性。包括HLA-DRB*0101，DRB*0301，DRB*0401，DRB*0701，Fig. 1. pMHC/TCR的整体复合物形成。（A）表示SLEELDLSL/MHCI/TCR的复合物形成。（B）表示ILYVDRNKL/MHCII/TCR的复合物形成。TCR显示在灰色条带中，MHC显示在绿色条带中，肽显示在蓝色条带和黄色棒中。红棒显示了TCR和MHC中参与氢键网络形成的氨基酸残基。H键以绿色虚线表示. (For在这个图例中，颜色的参考解释，读者可以参考本文的Web版本。等位基因表位肽RDOCK评分氢键数A*0201SLEELDLSL-21.98015Y. Tansiri等人医学信息学解锁25（2021）1006497=≤≤表5pMHC/TCR复合物的氢键相互作用表位肽MHC（等位基因）参与氢的粘结氢键等位基因DRB*1101和DRB*1501。黄色区域显示了位置194-227处的表位，其特异于MHC I类等位基因HLA-A*0201和MHC II类等位基因，包括HLA-DRB*0101、DRB*0401、DRB*0701、DRB*1101和DRB*1501。然而，预测的 肽 FN 15 仅 对 包 括 HLA-DRB *0101 、 DRB*0301 、 DRB*0401 、DRB*0701、DRB*1101、DRB*1501的MHCII等位基因具有高预测分数。3.4. 通过刺激IFNg评估细胞介导的免疫应答-rhKU_Sej_LRR_2271免疫兔产生T细胞，尤其是CD4+为了研究rhKU_Sej_LRR_2271蛋白上预测的T细胞表位的免疫原性，进行了特异性T细胞应答的测量。通过测量表6中所示的细胞内IFNg前体，评价了四种新设计的含有亲致性T细胞表位的肽刺激离体duction. 产生IFN g的T细胞（包括CD4+和CD4 + T细胞）的频率CD8+ T细胞在每次免疫之前和之后测量，新西兰白兔在免疫组之间比较所有4种预测肽的结果 和对照组 （n 3各）。用四种预测肽中的两种（LL17和SL19）刺激T细胞应答显示，与对照组相比，免疫兔组中离体产生IFN g的T细胞的频率显著更高（p值0.05），如图所示见图4。此外，如图4A所示，在第二次和第三次免疫后，这两种应答肽之一LL 17可以在免疫组中诱导比对照组显著更多数量的IFN-γ产生性T细胞。此外，来自免疫组的LL17特异性T细胞应答具有更高的频率。产生IFNg的T细胞和产生IFNg的CD4+ T细胞的数量图二. 在总模拟时间内，使用初始结构计算SLEELDLSL/MHCI/TCR（A）和ILYVDRNKL/ MHCII/TCR（B）的RMS偏差（RMS），表明整个分子复合物结构的稳定性， 参考。在第三次免疫后，与对照组相比，细胞数量增加（图4A和C）。在SL19特异性T细胞的测量中获得了类似的结果，与对照组相比，在第三次免疫后，来自免疫组的产生IFNg的T细胞的频率显著更高（图1B）。 4 B）。有趣的是，LL17特异性T细胞，包括CD 4+ T细胞，表现出强有力的IFN-γ产生ca-第三次免疫后的平静。然而，在兔中免疫后，用FN 15或VL 17肽刺激的T细胞的IFNg产生没有显著差异（数据未显示）。3.5. rhKU_Sej_LRR_2271蛋白在免疫家兔用ELISA法测定血浆中特异性IgG水平，评价免疫家兔的体液免疫应答。在第14、28和56天用杂合LRR蛋白免疫之前和之后，测定来自免疫组 和 对 照 组 的 特 异 性 IgG 的 水 平 。 结 果 显 示 ， 如 图 5 所 示 ， 用rhKU_Sej_LRR_2271蛋白免疫的兔在免疫后第14、28和56天血浆中杂合LRR蛋白特异性IgG的水平显著高于对照组。此外，与来自对照组的血浆相比，免疫后特异性抗体水平增加（p值0.05）。杂合LRR蛋白免疫家兔后，特异性体液免疫应答的增加在第二次免疫后第14天即第28天达到饱和， 直至 第三 次免 疫后 第14 天即 第56 天观 察结 束。 结果 表明 ，rhKU_Sej_LRR_2271蛋白免疫家兔后，血浆中产生了大量的特异性IgG。表位MHCTCR距离（mm）SLEELDLSLMHC I类：SER1THR1631.95（A*0201）GLU 1662.10TRP1671.87SER1001.93LEU2THR1631.94（HG1-O）THR1631.99（HN-OG1）公司简介2.4