工程5（2019）106免疫学研究综述基于自然杀伤细胞的肿瘤免疫治疗研究进展与展望袁虎a，田志刚b，张俊，蔡章a，a山东大学药学院免疫药理与免疫治疗研究所，济南250012b中国科学技术大学生命科学学院免疫学研究所，合肥230061阿提奇莱因福奥文章历史记录：收到2018年2018年10月10日修订2018年11月29日接受2018年12月30日在线提供保留字：自然杀伤细胞免疫治疗癌症临床试验嵌合抗原受体A B S T R A C T自然杀伤（NK）细胞是关键的先天免疫细胞，提供了抵御病毒感染和癌症的第一道防线。尽管NK细胞可以区分“自身”和“非自身”，识别异常细胞，并实时消除转化细胞和恶性肿瘤，但肿瘤发展了几种策略来逃避NK细胞的攻击。这些策略包括上调NK细胞抑制性受体的配体和产生可溶性分子或免疫抑制因子。各种类型的NK细胞目前正应用于临床试验，包括自体或同种异体NK细胞、脐带血（UCB）或诱导多能干细胞（iPSC）衍生的NK细胞、记忆样NK细胞和NK细胞系NK-92细胞，用于治疗不同类型的肿瘤。嵌合抗原受体（CAR）-NK细胞由于其重定向特异性和有效的抗肿瘤活性最近显示出巨大的潜力本文综述了肿瘤逃避NK细胞识别的机制、NK细胞免疫治疗的现状和进展、增强NK细胞体内抗肿瘤能力的方法以及该领域临床实践面临的主要挑战©2019 The Bottoms.Elsevier LTD代表中国工程院出版，高等教育出版社有限公司。这是一篇CC BY-NC-ND许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。1. 介绍自然杀伤（NK）细胞是先天免疫的主要组成部分的一个子集一旦被激活，NK细胞不仅可以快速溶解恶性细胞或病毒感染的细胞，而无需预先致敏且不受主要组织相容性（MHC）限制，而且还可以作为调节细胞，通过分泌几种细胞因子来启动和扩大针对肿瘤或感染细胞的适应性免疫应答[1，2]。NK细胞的效应子功能受抑制性受体和刺激性NK细胞通过杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR）与MHC I类分子的接合来区分正常组织[3，4]，这导致强抑制信号的传递以阻断NK细胞活化。一旦病毒感染的细胞或恶性转化的细胞失去其MHC I类分子，这些活化NK细胞受体，如NKG2D、NKp30、NKp46和NKp44，可以识别靶细胞上表达的应激诱导配体*通讯作者。电子邮件地址：tzg@ustc.edu.cn（Z. Tian），caizhangsd@sdu.edu.cn（C.Zhang）。从而为NK细胞杀伤靶标提供阳性信号[5NK细胞通常被认为是先天免疫细胞的组成部分之一，并且识别抗原而无特异性。然而，值得注意的是，一些研究人员发现NK细胞在某些情况下可能具有适应性免疫细胞的特征，例如记忆。已发现位于小鼠肝脏中的一组独特的组织驻留CD 49 a+ DX 5-NK细胞在皮肤接触炎症和流感病毒感染期间具有记忆特征[8最近，发现CD 49 a+ NK细胞亚群-小鼠CD 49 a+ DX 5-肝脏驻留NK细胞的可能的人类对应物-在人类肝脏中具有适应性免疫细胞的特征[12]。这些CD 49 a+ NK细胞可以通过在体外用白细胞介素-2（IL-2）、IL-12和IL-15刺激从外周血（PB）NK细胞中诱导;它们具有可比性。表型和功能特征，如干扰素-c（IFN-c）和NKG 2C的高表达[13]。此外，巨细胞病毒（CMV）和细胞因子的组合可以诱导NK细胞记忆应答。已发现鼠Ly49H NK细胞亚群在小鼠CMV感染期间发挥记忆应答并负责病毒清除[14]。类似地，人巨细胞病毒（HCMV）诱导的记忆NK细胞对CMV再攻击有应答，已经在人巨细胞病毒（HCMV）中鉴定出。https://doi.org/10.1016/j.eng.2018.11.0152095-8099/©2019 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一个在CC BY-NC-ND许可证下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表工程杂志主页：www.elsevier.com/locate/engY. Hu等人/工程5（2019）106107急性HCMV感染的受者接受造血细胞移植。这些CMV特异性NK细胞的表型为NKG 2C+、KIR+、CD 57+和NKG 2A-。这些记忆NK细胞在体内持续很长一段时间，在第一年后，同种异体移植，是IFN-c的有效生产者，急性感染和二次攻毒后[15，16]。此外，用IL-12、IL-15和IL-18短暂预活化诱导人NK细胞分化为表达CD 94、NKG 2A和NKG 2C但缺乏CD 57和NKG 2C的记忆样NK细胞。KIR。在再刺激后，这些精氨酸诱导的记忆样NK细胞显示出增加的IFN-c分泌[17]。值得注意的是，这些关于适应性NK细胞的发现有很大的希望。用于癌症或感染性疾病的免疫治疗在细胞因子诱导的记忆样NK细胞过继转移的I期临床试验中，NK细胞显示出对急性髓性白血病（AML）的强大抗肿瘤能力[18]。基于免疫细胞的免疫疗法-和嵌合抗原受体（CAR）-特别是T细胞-最近已成为癌症治疗的突破[19，20]。更具体地说，急性淋巴细胞白血病（ALL）的临床完全缓解率为在接受CD 19靶向CAR-T细胞输注的患者中高达70%-事实上，基于NK细胞的免疫疗法比基于T细胞或CAR-T细胞的疗法具有几个优势。I期和II期临床试验表明，同种异体NK细胞的过继转移安全且耐受性良好，不会导致移植物抗宿主病（GVHD）[22T细胞的来源通常限于自体细胞，但NK细胞可以从自体或同种异体PB制备，从骨髓或脐带血（UCB）获得，或从人胚胎干细胞或多能干细胞诱导;此外，NK-92细胞系可以直接使用此外，许多药物旨在武装NK细胞，达到良好的治疗效果。例如，称为ALT-803的IL-15和IL-15 R的超激动剂复合物可以结合表面IL-15受体并激活NK细胞[25，26]，从而促进NK细胞增殖和对血液恶性肿瘤和实体瘤（包括多发性骨髓瘤、卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌和结肠癌）的细胞毒性[27在一项I期临床研究中，观察到19%的可评估血液系统癌症患者在ALT-803给药后出现缓解，包括一次持续7个月的完全缓解[27]。因此，基于NK细胞的肿瘤免疫治疗显示出巨大的前景。本文综述了肿瘤逃避NK细胞识别的机制、NK细胞免疫治疗的现状和进展、提高NK细胞体内疗效的策略以及该领域临床实践面临的主要挑战。2. 肿瘤逃避NK细胞免疫监视的机制尽管NK细胞是先天抗癌免疫的主要组分，但肿瘤发展各种策略来逃避NK细胞攻击或损害NK细胞的活性和功能这些策略对NK细胞治疗的疗效有很大影响NK细胞功能障碍已在各种血液恶性肿瘤和实体瘤中报道[6，31例如，在免疫应激下，肿瘤细胞通常上调抑制性NK受体的配体的表达，例如人白细胞抗原-G（HLA-G），其是KIR2DL 4、免疫球蛋白样转录物2（ILT 2）和ILT 4的配体，以逃避NK细胞介导的细胞毒性[34]。已发现异位HLA-G表达与肿瘤患者的不良预后相关，这意味着该分子在肿瘤免疫逃逸中起作用[35]。HLA-G抑制增殖和细胞毒性，通过与ILT 2结合，NK细胞的活性和减少IFN-α和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的产生[36]。它据报道，尤因肉瘤上表达的HLA-G抑制表达GD 2特异性CAR的NK细胞的活性[37]。慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者肿瘤细胞上HLA-G的阻断增加了肿瘤肿瘤逃避NK细胞监视的另一个重要机制涉及肿瘤细胞产生的可溶性分子或配体。IL-2是细胞增殖和活化所必需的NK细胞。然而，由肿瘤产生的可溶性IL-2 Rα可以结合IL-2，并阻止其与NK细胞表面的膜IL-2 R结合，导致对外源性IL-2给药不敏感和NK活性受损[39]。也有报道称，NK细胞功能受损与可溶性配体的血清水平升高相关，如NKp 30的BAG 6，NGK 2D的MHC I类相关链A（MICA）和ULBP 1 -3[32，40]。从肿瘤细胞脱落的可溶性配体阻止特化NK细胞识别肿瘤细胞膜上的配体[41肿瘤细胞通过蛋白质二硫键异构酶ERp5、去整合素和金属蛋白酶ADAM 10和ADAM 17的活性将配体从细胞膜上脱落[42，44]。Ferrari de Andrade等人[45]最近设计了针对MICA和MHC I类相关链B（MICB）的蛋白水解切割位点的抗体，并证实这些抗体有效地防止MICA和MICB从肿瘤细胞表面脱落，从而重新激活NK细胞的抗肿瘤免疫力。肿瘤逃逸的主要机制与肿瘤微环境（TME）有关，TME由免疫抑制细胞（例如，调节性T细胞（TCFs）、肿瘤相关巨噬细胞（TAM）和髓源性抑制细胞（MDSC））、可溶性因子、在肿瘤细胞或抗原呈递细胞上表达的抑制分子和细胞外基质。免疫抑制微环境不仅促进肿瘤生长和迁移，而且还帮助肿瘤细胞逃避宿主免疫的监视并抵抗免疫治疗[46肿瘤细胞分泌各种免疫抑制因子，如转化生长因子-b（TGF-b）、IL-10、吲哚胺2，3-双加氧酶（IDO）和前列腺素E2（PGE 2），这些因子抑制NK细胞的抗肿瘤活性[50]。几个研究小组已经证明，肿瘤细胞衍生的IDO和PGE 2显著抑制NK细胞的细胞毒性和细胞因子产生[51，52]。几种抑制性细胞，如TCF 3、MDSC和M2-巨噬细胞可通过分泌IL-10和TGF-β来削弱肿瘤内NK细胞的细胞毒性[53，54]。TME中的肿瘤细胞、抗原呈递细胞和基质细胞表达高水平的抑制性分子，例如程序性死亡配体1（PD-L1），以通过与NK细胞上各自的抑制性受体连接来防止NK细胞活化，从而导致NK细胞功能障碍或甚至衰竭[6，55因此，肿瘤浸润性NK细胞通常表现出衰竭状态并易于凋亡;它们的特征还在于活化受体表达降低、抑制性受体（例如，NKG2A，共抑制受体T细胞免疫球蛋白，免疫受体基于酪氨酸抑制基序域（TIGIT）和T细胞免疫球蛋白和含有粘蛋白结构域的-3（Tim-3）），以及IFN-α和TNF-α的低分泌[33，55，58]。阻断这些抑制性检查点受体可以恢复NK细胞的耗竭，并显著提高免疫治疗的疗效[59]。设计合适的策略克服肿瘤免疫逃逸机制，特别是克服免疫抑制微环境，对于基于NK细胞的抗肿瘤免疫治疗获得理想的治疗效果至关重要。108Y. Hu等人/工程5（2019）106×·3. 基于NK细胞的肿瘤免疫治疗研究现状3.1. 外周血来源的自体或异体NK细胞用于肿瘤免疫治疗通过过继免疫疗法治疗肿瘤的最初尝试涉及转移源自PB的IL-2活化的自体NK细胞[60]，因为这些细胞已显示可减少鼠模型中肺转移瘤的生长然而，当该方法用于临床时，仅观察到有限的抗肿瘤作用[60，61]。这种有限作用的主要原因是肿瘤细胞上的自身HLA分子与自体NK细胞上的KIR匹配，导致NK细胞活性受到抑制。后来，采用了KIR配体错配的同种异体或单倍体相合NK细胞，以克服由于肿瘤细胞的“自我缺失”识别而导致的这种抑制[62]。输注同种异体NK细胞减少了移植物的宿主排斥反应，同时消除了白血病复发，从而确保了疗效和安全性。几项临床试验表明，NK细胞输注耐受性良好，无GVHD、细胞因子释放综合征（CRS）或神经毒性[24，63对于血液恶性肿瘤，如难治性非霍奇金最近的一项临床试验显示，所有可评价的高危MDS和AML患者（5/+5可评价）在接受半相合NK细胞输注后均达到客观缓解[65]。还评估了同种异体NK细胞输注（通常与抗体治疗联合）在实体瘤中的疗效例如，在治疗晚期胃癌或结直肠癌患者的I期临床试验中，过继性NK细胞疗法与曲妥珠单抗或西妥昔单抗化疗联合给药6例可评价患者中有4例疾病进展稳定。重要的是要注意联合治疗显著促进IFN-c的产生，并减少了外周中的T细胞的数量，从而导致这4名稳定患者中的3名的肿瘤大小减小[68]。另一项I期临床试验中，同种异体NK细胞输注联合西妥昔单抗治疗胃肠道癌肝Meta，9例患者中有3例出现客观临床缓解[70]。 这些试验中反应差的常见问题与供体NK细胞体内寿命有限（通常为两周）以及与IL-2给药相关的TcR增加有关。两项临床试验（NCT00274846和NCT 01106950）使用IL-2-白喉融合蛋白在输注单倍相合的NK细胞用于AML的治疗。结果显示，使用IL-2-白喉融合蛋白的治疗提高了完全缓解率和无病生存率，这与有效的Treg耗竭、供体NK细胞扩增和较高的血清IL-15水平相关[72]。通过给予外源性IL-15而不是IL-2可以进一步提高治疗效果，因为IL-15不促进TcB的存活和扩增[73，74]。3.2. 用于肿瘤免疫治疗除了来自PB的NK细胞之外，UCB和诱导多能干细胞（iPSC）目前通过与支持性饲养细胞共培养或通过单独与细胞因子组合刺激而用作功能性NK细胞的来源UCB或iPSC的突出优势，如广泛的可用来源和易于在良好生产规范（GMP）标准下进行临床级扩增，预计将允许UCB或iPSC在临床上应用。iPSC衍生的NK细胞成为癌症免疫治疗的目前，已经很好地建立了用于UCB和iPSC衍生的NK细胞的大规模临床级扩增技术建立了一种从CD34+UCB中扩增NK细胞的高对数规模体外用于过继免疫疗法该方法允许大于15000倍的扩增效率和100%的纯度。使用补充有细胞因子组合的新型临床级培养基扩增来自UCB的CD 34+造血祖细胞;该过程产生具有NK细胞受体表达和有效裂解肿瘤细胞（包括白血病和实体瘤）能力的功能性CD 56+ NK细胞[75]。iPSC衍生的NK细胞可以通过具有细胞因子（包括IL-3、IL-7、IL-15、SCF和Flt 3L）的组合而没有外源基质细胞的两阶段培养系统扩增100-已在各种类型的肿瘤（包括血液癌和实体癌）中评估了UCB或iPSC衍生的NK细胞的抗肿瘤活性[76然而，与PB单核细胞（PBMC）衍生的NK细胞相比，从UCB或iPSC扩增的NK细胞具有较差或相似的抗肿瘤功能[76此外，UCB和iPSC衍生的NK细胞表达低水平的KIR;这引起了对NK细胞教育的担忧，这是NK细胞被赋予不同效应子能力同时保持对自身HLA耐受的过程[85受过教育的NK细胞通常具有较低的激活或抑制信号传导阈值，而未经教育的NK细胞对激活或抑制反应迟钝相反，最近的一项研究表明，与来自PBMCs的受过训练的NK细胞相比，来自UCB的未经训练的NK细胞对表达HLA的宫颈肿瘤细胞系具有更好的细胞毒性[84]。因此，NK细胞的培养对于癌症的免疫治疗是否必不可少仍有待回答目前有五项临床研究集中在UCB衍生的NK用于治疗复发性或难治性血液肿瘤和实体瘤的细胞。目前有4项研究（ NCT 01729091 、 NCT 03019640 、 NCT 02280525 和 NCT03539406）正在招募患者。一项试验（NCT 00354172）已完成研究。这项临床研究的目的是找到NK细胞的最高耐受剂量，可以与化疗一起给予患者，CLL，并了解NK细胞的加入是否有效治疗这种疾病。临床结果显示，15例血液系统癌症患者中有2例在接受脐血来源的NK细胞输注治疗后无病存活6个月。3.3. 基于NK细胞系的肿瘤免疫治疗有几种已建立的NK细胞系，包括NK-92、NKL、YT、NK-YS和NKG[89其中，NK-92细胞显示出对恶性细胞的稳健和广谱细胞毒性，并且是唯一获得美国食品和药物管理局（FDA）批准用于临床试验的细胞系[92]。NK-92细胞在临床实践中具有几个优点。与同种异体或UCB衍生的NK细胞相比，它们在GMP条件下容易扩增，这导致患者的成本较低。NK-92细胞可以用病毒或非病毒载体有效地操作，以增强其靶向、归巢和杀伤活性。临床试验结果已经证实了输注NK-92细胞的安全性，即使剂量为1 × 10× 10细胞/m2[93NK-92细胞输注在黑素瘤、肉瘤、结直肠癌、肾癌、肺癌和AML患者中的疗效已得到评估。肺癌患者（4例中的3例）或肾细胞癌患者（11例中的5例）在实现混合缓解或疾病稳定方面的临床缓解似乎优于其他患者[93，94]。最近的一项使用IL-2激活的NK-92细胞的I期临床试验证明了它们的安全性和可行性，以及在7名患者中的3名中的短暂活性。Y. Hu等人/工程5（2019）106109难治性和复发性AML[95]。然而，由于这些NK细胞在体内的有限持久性，基于NK-92的疗法的功效仍然有限，即使重复输注也是如此。此外，由于NK- 92细胞来源于NHL患者，因此必须在输注前进行辐照，以完全消除增殖[96]。然而，这种辐照过程严重损害了它们在体内的持久性，因此它们通常在几天内无法在循环中检测到[94]。虽然更频繁的细胞输注可能是改善持久性的简单方法，但这种解决方案引起了关注，因为它可能引起针对NK-92细胞上表达的HLA抗原的体液免疫应答。因此，一些研究小组正试图通过基因修饰（如表达CAR的NK-92细胞）来重定向特异性并改善临床结果。3.4. 记忆样NK细胞尽管NK细胞是先天免疫的主要组成部分，但最近的证据表明NK细胞显示记忆样适应性特征。已经报道了具有记忆样免疫应答特征的三种类型的NK细胞：马槟榔碱诱导的记忆样NK细胞、CMV特异性NK细胞和肝脏驻留NK细胞[97]。记忆样NK细胞的共同特征是：表达较高水平的NKG 2C;在体内长期增殖，和持久性;和增加IFN-c分泌后，再刺激，与抗原或细胞因子结合时，或与肿瘤细胞接触时。这三种类型的不同之处在于，马槟榔碱诱导的记忆样NK细胞和CMV特异性NK细胞对靶点发挥更强的细胞毒性，而肝脏驻留的NK细胞表现出较差的脱粒[12]。尽管NK细胞免疫治疗已经取得了很大的进展，但由于NK细胞在体内的寿命短和细胞毒性低，临床疗效仍然有限。记忆性NK细胞的记忆特性和长期在体内的增殖和持久性，使其这是一个可能的突破，是一种基于NK细胞的肿瘤免疫疗法的新来源。通过用细胞因子IL-12、IL-15和IL-18的各种组合预活化人PB衍生的NK细胞获得人精氨酸诱导的记忆样NK细胞[17，18，98，99]。这些记忆样NK细胞目前正在临床研究中进行评估，并已完成I期临床试验。在短暂的预活化和过继转移后，这些NK细胞在异种移植小鼠模型中显示出对AML的稳健抗肿瘤活性[18]。在临床研究中，转移的记忆样NK细胞增殖并在第7天至第14天达到峰值;此外，当将第7天与输注后第1天（第1天）进行比较时，它们平均扩增了419倍[18]。值得注意的是，扩增的记忆样NK细胞显示出有效的抗白血病功能。9例接受记忆样NK细胞转移的AML患者中有5例获得临床应答，其中4例完全缓解[18]。到目前为止，马槟榔碱诱导的记忆样NK细胞的功效仅在AML患者中进行了测试。其他类型的肿瘤，特别是实体瘤，仍有待评估。在HCMV感染期间也发现了记忆NK细胞应答Foley等人[15]已经表明，在同种异体造血移植受者中，供体来源的NK细胞表现出记忆样特征，NKG 2C+ NK细胞和再活化时更高的IFN-cCMV感染-在减少复发方面发挥重要作用的特征。激活受体NKG 2C，其配体是HLA-E，可能作为这些记忆样NK细胞的标志物。CMV诱导的NKG 2C+ NK细胞在体外显示出对强表达HLA-E的肿瘤的强细胞溶解活性通过增加脱粒和IFN-c分泌[100，101]。此外，还提供了一种用于体外扩增的有效方法，已建立NKG2C+NK细胞[102]。NKG 2C+ NK细胞优先从健康供体中体外扩增，方法是用HLA-E转染的721.221细胞作为饲养细胞培养，然后用IL-15刺激2周[101，102]。离体扩增的NKG 2C+NK细胞表现出分化的表型，包括NKG 2A、CD 7、CD 16和siglec-7的低表达以及CD 2、CD 57、CD 226和颗粒酶B的高表达[102]。重要的是要注意，这些扩增的NKG 2C+ NK细胞携带单一的自身特异性KIR，这使得它们能够完全克服HLA-C屏障并对错配的肿瘤细胞发挥更强的细胞毒性。尽管存在某些需要解决方案的挑战，例如低扩增（14天扩增后2-值得注意的是，NKG 2C+适应性NK细胞经第三代抗CD 19-CAR工程改造，与所有其他NK亚群相比，表现出优异的细胞溶解能力，从而证实了其可行性，并证明了CAR修饰的原代适应性NK细胞在癌症免疫治疗中的巨大前景[104]。肝脏抗原特异性记忆NK细胞首次在小鼠中发现[8]。肝脏含有两种不同类型的NK细胞：肝脏驻留的CD 49 a+ DX 5- NK细胞和常规的CD 49a-DX 5+ NK细胞。在接触性超敏反应模型中，肝脏驻留的CD 49 a+ DX 5-NK细胞具有记忆潜力，在激发后具有强大的回忆反应[8，105，106]。后来，在人类中类似地鉴定出具有记忆样特征的肝内CD49a+NK细胞群体[12]。人肝内CD49a+ NK细胞表达高水平的NKG2C和低水平的NKG2A、CD16、CD57和穿孔素。在刺激后，CD49a+ NK细胞产生大量的炎性细胞因子，但去炎性作用差。最近的研究表明，IL-12和IL-15可以在体外刺激PB NK细胞分化为CD 49 a+ CXCR 6+ NK细胞[13]。这些CD49a+ CXCR6+ NK细胞表达高水平的NKG 2C并产生IFN-c，表型和功能为肝脏驻留的CD49a+ NK细胞。人肝内CD49a+ NK细胞有望成为肝癌及相关慢性肝病免疫治疗的理想NK细胞3.5. CAR-NK细胞用于肿瘤免疫治疗使用CAR-T细胞的连续免疫疗法在治疗血液恶性肿瘤方面具有显著的积极临床结果[107，108]。使用CD 19靶向CAR-T细胞治疗复发性B-ALL和某些类型的复发性NHL已获得FDA批准。然而，仍然存在许多困扰这种临床应用的障碍CAR-T细胞的输注通常伴有副作用，如CRS、神经毒性和靶向/脱瘤效应[109]。CAR-T细胞通常由患者自体血液中的T细胞制备CAR-NK细胞具有克服这些限制的几个优势[20，110]。CAR-NK细胞可以作为“现成”产品制备，而NK细胞通常分泌有限水平的IFN-α和GM-CSF，并且不分泌IL-1和IL-6，它们是启动CRS的主要细胞因子。此外，CAR-NK细胞保留其天然受体，如NKp 46、NKp 30、NKp 44、NKG 2D和CD 226，这些受体识别不依赖于CAR的应激诱导配体;因此，它们可以降低与CAR靶向抗原丢失相关的复发可能性。110Y. Hu等人/工程5（2019）106鉴于NK细胞的上述优点，CAR-NK细胞现在正在探索用于血液肿瘤和实体肿瘤的治疗，并且已经显示出巨大的前景。在临床前研究中，CAR-NK细胞在小鼠荷瘤模型中显示出强大的抗肿瘤功效。例如，与转移未修饰的NK-92细胞相比，转移野生型表皮生长因子受体（EGFR）和EGFRvIII靶向CAR-NK-92细胞显著降低了胶质母细胞瘤的生长，并有效延长了荷瘤小鼠的生存时间[111]。用磷脂酰肌醇-3（GPC 3）靶向CAR-NK-92细胞治疗肝细胞癌也显著降低了原位异种移植模型中的肿瘤负荷[112]。然而，仍然存在影响CAR-NK细胞的有效临床转化的几个限制。与T细胞相反，由于对PB衍生的NK细胞的转染效率低和体内持久性短，装备CAR-NK细胞具有挑战性[110]。许多研究人员正在探索提高原代NK细胞免疫效果的方法，但尚未取得显著进展。Shimasaki等人[113]已使用mRNA电穿孔将抗CD 19-CAR传递至人原代NK细胞中。在电穿孔后24h，抗CD 19-CAR在新鲜纯化的NK细胞中的表达水平达到40.3%，在扩增的NK细胞中的表达水平达到61.3%，这种修饰NK细胞的方法在体外显著增强了NK细胞对CD19+肿瘤细胞的特异性细胞溶解。治疗后小鼠的肿瘤负荷显著降低，但由于短暂的抗肿瘤作用，在后期出现复发[113]。到目前为止，正在进行两项利用mRNA电穿孔生产CAR-NK细胞的临床试验，以评估这种疗法的安全性和可行性一项试验是由新加坡国立大学卫生系统申办的靶向CD 19治疗B淋巴恶性肿瘤（NCT01974479），另一项试验是由广州医科大学附属第三医院（中国广州）于2018年申办的使用NKG 2D配体靶向CAR-NK细胞治疗转移性实体瘤患者（NCT 03415100）。为了克服CAR和低转染效率，并且为了获得稳定的表达CAR的NK细胞，几个研究组已经开始使用NK-92细胞或UCB/iPSC衍生的NK细胞作为优良的CAR驱动物。CAR-NK-92细胞对CAR靶向肿瘤显示出强大的活性。 许多肿瘤抗原被用作CAR-NK细胞研究中的靶标，包括来自血液恶性肿瘤的肿瘤抗原（例如，CD 19、CD 20、CD 33、CD 138和CS-1）[114 -118]和实体瘤（例如，HER 2、erbB 2、EpCAM、间皮素、GD 2、GPA 7、GPC 3、PSCA、EGFR和EGFRvIII）[37，111 ， 112 ， 119 -123] 。 5 项临 床 研 究 （ NCT 02892695 、 NCT02742727、NCT 02944162、NCT 03383978和NCT 02839954）在I期和II期集中于表达针对淋巴瘤和白血病的CD19、CD 7和CD 33特异性CAR;针对胶质母细胞瘤的HER 2特异性CAR;以及针对MUC 1+复发性或难治性实体瘤的MUC 1特异性CAR的NK-92细胞。虽然CAR修饰可以增加NK-92细胞对靶细胞的溶细胞潜力，但NK-92细胞的持久性由于在给药前进行照射，因此在体内仍然是有限的。Liu等人[124]提出了一种从UCB衍生的NK细胞产生CD 19特异性CAR-NK细胞的新方法，并声称他们的方法可以提高NK细胞的体内转染效率和持久性。用含有CD 19特异性CAR基因和IL-15基因的逆转录病毒载体对NK细胞进行遗传修饰，以驱动NK细胞的扩增和持久性，并用诱导型半胱天冬酶-9在必要时消除转导的细胞。与仅CAR转导的NK细胞相比，这种修饰，特别是IL-15的引入，显著改善了体内NK细胞的增殖和持久性，并增强了抗肿瘤活性。 值得注意的是，CAR-NK细胞能够持续至少输注后68天[124]。由MD安德森癌症中心申办的一项临床试验（NCT03056339）于2017年获得批准，旨在评估输注UCB衍生的CD 19特异性CAR-NK细胞是否会改善复发性或难治性B淋巴恶性肿瘤干细胞移植患者的疾病。4. 挑战和前景越来越多的研究和临床试验已经证明NK细胞在癌症治疗的临床应用中的优越性采用各种方法来增强NK细胞的体内增殖、持久性和抗肿瘤能力（图1B）。①的人。然而，NK细胞的疗效仍然不足，特别是对于实体瘤的治疗。许多挑战限制了基于NK细胞的免疫疗法的功效;特别的挑战包括有限的体内增殖和持久性，以及TME的免疫抑制。已经提出多种策略的不同组合来增强NK细胞的抗肿瘤功效，延长其在体内的存活和持久性，并从TME中的耗竭恢复NK功能NK细胞是一组具有不同功能亚群的异质细胞，例如组织驻留NK细胞、记忆样NK细胞和单个自身特异性表达KIR的NK细胞。选择性扩增合适的NK细胞亚群并将其应用于适当类型的肿瘤是值得探索的。UCB衍生的NK细胞或记忆样NK细胞比PB衍生的NK细胞具有更长的寿命，因此可以是NK细胞疗法的理想来源细胞因子如IL-12、IL-15和IL-21的组合的引入可进一步增强这些NK细胞的体内增殖和持久性CAR是改善NK细胞的细胞溶解活性的有力工具;然而，只有少数研究基于NK细胞特征设计了CAR构建体[120，125]。因此，大多数CAR-NK细胞与CAR-T细胞共享CAR的主要构建体一个有前途的研究领域是设计一种适合NK细胞的CAR的优化结构，然后将CAR克隆到记忆样NK细胞或特定的NK细胞亚群中。Kaufman及其同事[126]最近设计并测试了9种不同的NK细胞特异性CAR构建体，其含有不同的NK细胞特异性激活结构域，并利用人iPSC产生间皮素靶向的CAR-NK细胞。NK特异性CAR-NK细胞，特别是优化的NKG 2D-2B 4f-iPSC-NK细胞，在卵巢癌异种移植模型中显示出显著增强的细胞溶解能力，显著抑制肿瘤生长，并延长生存期[126]。重要的是要注意，NK细胞特异性CAR介导的信号传导活性有效地改善了NK细胞的体内此外，NK细胞通常在TME中以功能障碍或衰竭的状态被诱导[6]，这显著削弱了它们的持久性和细胞毒性。靶向TME的策略可以改善基于NK和CAR-NK细胞的免疫疗法的功效。一些研究表明，阻断PD-1通路可以部分逆转NK细胞的功能障碍和耗竭[127，128]。在各种肿瘤模型中，发现PD-1的水平在肿瘤浸润NK细胞上特异性上调，PD-L1+肿瘤细胞与PD-1的结合有效抑制NK细胞介导的抗肿瘤免疫应答。因此，NK细胞受损的抗肿瘤活性可通过PD-1和PD-L1阻断恢复[127]。值得注意的是，发现TIGIT在肿瘤浸润性NK细胞和T细胞上高度表达，并且TIGIT的水平与肿瘤进展以及T细胞和NK细胞两者的功能耗竭正相关，使得TIGIT成为重要的检查点受体[59，129阻断TIGIT显著逆转NK细胞耗竭并恢复两种NK细胞Y. Hu等人/工程5（2019）106111Fig. 1.用于肿瘤免疫治疗的NK细胞的各种来源。答：将来自健康供体的自体NK细胞或具有错配KIR的同种异体NK细胞从PB中纯化，然后在施用于患者之前用细胞因子（IL-2或IL-15）活化。B：UCB和iPSC通过与支持性饲养细胞共培养或通过单独用细胞因子组合刺激而用作功能性NK细胞的来源。C：NK细胞系NK-92细胞，在输注前用1000 cGy辐照，是NK细胞疗法的另一个重要来源。D：细胞因子诱导的记忆样NK细胞通过用细胞因子如IL-12、IL-15和IL-18的组合预活化人PB衍生的NK细胞获得。E：NKG 2C+适应性NK细胞优先通过与HLA-E转染的NK细胞培养从健康供体中离体扩增。721.221细胞作为饲养细胞和IL-15。F：NK细胞可以通过mRNA电穿孔或病毒载体用CAR进行遗传修饰，以重定向特异性并增强基于NK细胞的免疫疗法的抗肿瘤功效。和T细胞在不同的实体瘤模型中;它也最终延长了荷瘤宿主的总体生存期[59]。据报道，另一种共抑制受体Tim-3在来自不同类型实体瘤患者的肿瘤浸润NK细胞上高度表达，所述实体瘤例如转移性黑素瘤、肝细胞癌、乳腺癌和结肠癌。肿瘤浸润NK细胞上Tim-3的水平与黑色素瘤患者的肿瘤进展和不良预后呈正然而，发现用抗体阻断Tim-3可逆转NK细胞耗竭并显著恢复NK细胞的抗肿瘤功效[132，133]。因此，CAR 转导的NK 细胞与检查点抑制（例如，阻断PD-1、TIGIT、NKG 2A或Tim-3）可能进一步增加对癌症的抗肿瘤免疫应答。类似的策略包括联合治疗，消除或阻断来自MDSC、TME、TAM、TGF-β的免疫抑制和TME中的其他免疫抑制总之，NK细胞惊人的抗肿瘤活性终于被转化为临床，在那里它已经显示出显着的希望。精心设计的理想策略可以与先进技术相结合，以改善NK细胞的增殖，持久性和功能，并克服临床转化中的瓶颈，将使过继性NK细胞免疫治疗的疗效最大化。确认本工作得到了国家自然科学基金（81788101，81761128013，81771686、81472646、91842305、31390443和91542000）和中国科学院（XDB 29030000）。遵守道德操守准则袁虎、田志刚和张蔡声明，他们没有利益冲突或财务冲突需要披露。引用[1] 郑明，陈英，肖伟，孙荣，田志。NK细胞为基础的免疫治疗恶性疾病。 Cell MolImmunol 2013;10（3）：230-52.[2] 小TS。先天免疫和炎症。Cell Mol Immunol 2017;14（1）：1-3.[3] 杨伟，刘伟，李伟，刘伟，李伟. 控制自然杀伤细胞反应：激活和抑制信号的整合。Annu RevImmunol 2013;31（1）：227-58.[4] Martinet L ， Smyth MJ. 通 过 配 对 受 体 平 衡 自 然 杀 伤 细 胞 激 活 。 Nat RevImmunol2015;15（4）：243-54.[5] De Pelsmaeker S，Romero N，Vitale M，Favoreel HW.疱疹病毒逃避自然杀伤细胞。病毒学杂志 2018;92（11）：e02105-17。[6] 孙聪，孙海艳，肖文宏，张聪，田志国.肝癌自然杀伤细胞功能障碍与NK细胞免疫治疗Acta PharmacolSin 2015;36（10）：1191-9。[7] Berry R，Ng N，Saunders PM，Vivian JP，Lin J，Deuss FA，et al. 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