工程17（2022）161研究冠状病毒疾病2019-文章通过单细胞转录组测序鉴定严重感染患者张燕a，#，王舒婷a，#，何霞a，#，郭静a，何康欣a，黄晨杰a，罗锐a，陈燕飞a，徐开金a，高海女b，盛继芳a，李兰娟a，李玉a浙江大学医学院附属第一医院感染科感染病诊疗国家重点实验室，国家感染病临床研究中心，感染病诊疗协同创新中心，杭州310003b浙江树人大学舒兰国际医学院附属舒兰（杭州）医院，中国杭州310022阿提奇莱因福奥文章历史记录：2021年1月22日收到2021年5月7日修订2021年5月17日接受2021年6月12日在线提供保留字：COVID-19重症感染重症单核细胞纤维化A B S T R A C T了解严重冠状病毒病2019（COVID-19）中单核细胞的免疫学特征-包括与纤维化相关的特征-对于了解疾病的致病机制和预防疾病严重程度至关重要在这项研究中，我们对从6名健康对照和14名COVID-19样本中采集的外周血样本进行了单细胞转录组测序，其中包括3名重度/危重患者和4名中度患者的重度、中度和恢复期样本。我们发现，在患有COVID-19的重症/危重症患者中，单核细胞强烈重塑，单核细胞比例增加，多样性严重降低此外 ， 我 们 发 现 了 两 个 新 的 严 重 疾 病 特 异 性 单 核 细 胞 亚 群 ： Mono 0和 Mono 5。 这 些 亚 群 表 达 双 调 蛋 白（AREG）、表皮调节蛋白（EREG）和细胞因子白细胞介素-18（IL-18）基因，表现出富集的成红细胞白血病病毒癌基因同源物（ErbB）信号传导途径，并且似乎表现出促纤维化和促炎症特征。我们还发现了Mono 0和Mono 5的代谢变化，包括糖酵解/糖异生增加和缺氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路增加。值得注意的是，一份重度前样本显示出与重度/危重样本相似的单核细胞图谱。总之，我们的研究发现了两种新的严重疾病特异性单核细胞亚群作为严重COVID-19的潜在预测因子和治疗靶点。总的来说，这项研究为COVID- 19的严重疾病和治疗靶点提供了潜在的预测因子，从而为进一步研究COVID-19提供了资源©2021 THE COUNTORS.Elsevier LTD代表中国工程院出版，高等教育出版社有限公司。这是一篇CC BY-NC-ND许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）中找到。1. 介绍2019冠状病毒病（COVID-19）在全球迅速蔓延，截至2021年1月底，感染人数超过9，000万。大约20%的感染患者发展为严重疾病，死亡率为4%[1]。然而，发展成严重疾病的发病机制仍不清楚。因此，迫切需要对这方面进行研究，以降低死亡率，改善预后。*通讯作者。电子邮件地址：ljli@zju.edu.cn（L. Li）。#这些作者对这项工作做出了同等贡献，应被视为共同第一作者。先天性和适应性免疫反应在COVID-19发展为严重疾病中起着重要作用因此，了解COVID-19严重感染或危重患者的独特免疫学特征至关重要。单核细胞代表重要的先天免疫细胞群体。在严重感染或重症COVID-19患者中，单核细胞和巨噬细胞过度增殖[2]，引发继发性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症（sHLH）[3]，并导致细胞因子风暴和致命结局[3]。此外，大量单核细胞已显示浸润到肺、心脏、淋巴结、脾、肾和其他器官中。此外，单核细胞是诱导肺纤维化的主要细胞类型之一[4，5]。在严重感染或危重的COVID-19患者中，肺纤维化是常见的[6]。直到https://doi.org/10.1016/j.eng.2021.05.0092095-8099/©2021 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表工程杂志首页：www.elsevier.com/locate/engY. Zhang，S.Wang，H.Xia等人工程17（2022）161162·-目前，没有一项大规模研究报告了COVID-19幸存者的长期随访结果;然而，根据严重急性呼吸综合征（SARS）和中东呼吸综合征（MERS）的经验，预计许多幸存者将留下纤维化。反过来，纤维化导致肺功能下降，一些危重病例甚至进展为不可逆的肺功能丧失，需要肺移植才能生存[7]。COVID-19引起的肺纤维化将是一个巨大的负担。因此，了解严重感染或重症COVID患者中单核细胞的免疫学特征--包括与纤维化相关的免疫学特征-19对于了解致病机制、预防严重疾病和开发有效治疗至关重要。在这项研究中，我们应用单细胞RNA转录组测序（scRNA-Seq）对来自严重或危重、严重前、中度和恢复期COVID-19疾病状况和健康对照的外周血单核细胞（PBMC）中的单核细胞进行了深入的表型分析，以了解单核细胞的特异性免疫特征，并确定单核细胞亚群对严重或危重COVID-19的贡献。2. 方法2.1. 受试者入组和临床特征本研究于2020年2月至2020年4月在浙江大学附属第一医院前瞻性入组了总体而言，根据COVID-19指南入组了3例重度感染或危重患者和4例中度感染患者（附录A中的表S1）。其中一名中度感染的患者最终在随访期间发展为严重疾病，因此在本研究中被称为表1列出了7名患者和6名健康对照的特征和临床过程。 我们收集了7名COVID-19患者在疾病和恢复期间的PBMC样本（图11）。① 的人。总共20个PBMC样品，包括1 - 4个COVID-19患者的PBMC样品和6个健康对照的PBMCs样品，并将其分类为中度组（M组，M1 -4，在中度感染状况期间收集的PBMC样品）、严重感染或危重病组（S组，S1-3，在严重感染或危重病状况期间收集的PBMC样品）、恢复期/恢复组（R组，R1-7，在恢复状况期间收集的PBMC样品）和对照/正常组（N组，N1-6）（图1A）。①的人。此外，随访患者的临床病程、结局和肺纤维化。值得注意的是，采集样本M2的患者在入组时为中度病例，最终发展为重度疾病（图1）。在我们的研究中，所有与S组相关的患者（S1 -3）和一名与M组相关的患者（M2）在随访期间发现肺纤维化（图11）。 2）的情况。2.2. PBMC制备和储存根 据 制 造 商 的说 明 ， 使 用 Ficoll-PaqueTM PRE- MIUM （ GEHealthcare，USA）从COVID-19病例和健康对照的外周静脉血中获得PBMC将PBMC重悬于冷冻溶液（10%二甲基亚砜（DMSO）和90%非灭活胎牛血清（FBS））中，以1 ℃ min-1的速率将温度降至80℃逐渐冷冻，并在液氮中冷冻保存直至使用[8]。使用BD RhapsodyTM单细胞分析系统（BD Biosciences，USA）捕获单个PBMC的转录组学数据。通过使用有限稀释法将单细胞悬浮液随机分布在超过200 000个微孔中来获得单细胞捕获。过量补充携带寡核苷酸条形码的珠粒以实现微孔中单个细胞的珠粒配对。在微孔中进行细胞裂解以使信使RNA（mRNA）与条形码化寡核苷酸杂交。将珠粒进一步转移到管中用于逆转录和ExoI消化。此外，每个互补DNA（cDNA）在其50末端用唯一的分子标识符进行标记图1.一、入组我们研究的7名COVID-19患者的临床病程的时间轴对SARS-CoV-2核酸进行逆转录定量实时聚合酶链反应“RT-qPCR+”表示样本为SARS-CoV-2核酸阳性。左侧的彩色条表示7名患者入组时的疾病状况。患者5（P05）在采集M2样本4天后最终出现严重疾病。S1Y. Zhang，S.Wang，H.Xia等人工程17（2022）161163（UMI）和显示相应单元格的单元格条形码。使用BD RhapsodyTM全转录组分析（WTA）扩增试剂盒（BD Biosciences）进行全转录组文库制备，包括随机引发和延伸（RPE）、RPE扩增聚合酶链反应（PCR）和WTA索引PCR。基于Qubit高灵敏度DNA测定试剂盒（Thermo FisherScientific，USA），使用高灵敏度DNA芯片（Agilent，USA）和Bioanalyzer 2200（Agilent）进行文库定量。测序在Illumina测序仪（Illumina，USA）上进行，具有150个碱基对（bp）配对末端运行。2.3. 单细胞RNA测序scRNA-Seq 数 据 由 NovelBioBio-PharmTechnology 使 用NovelBrain Cloud Analysis Platform进行分析。将UMI工具应用于单细胞转录组RNA分析以鉴定细胞条形码的白名单。通过使用STAR映射将基于UMI的干净数据映射到人类基因组（Enclusion版本91），所述STAR映射具有来自UMI工具的标准管道的定制参数，以获得每个样品的UMI计数。检测基因超过200个且线粒体UMI率低于30%的细胞被认为通过细胞质量控制，排除线粒体基因。Seurat软件包3.1μ m用于表达表之后的细胞标准化，考虑各种样品的UMI计数和线粒体基因的百分比以产生缩放的数据。然后，对标度数据进行主成分分析（PCA）以确定前2000个高度可变的基因和前10个主成分，以及t分布随机邻居嵌入（tSNE）和均匀流形近似和投影（UMAP）构造。使用基于图的聚类技术（分辨率= 0.8），根据PCA导出的前10个主成 分 获 得 无 监 督 细 胞 聚 类 结 果 。 通 过 Wilcoxon 秩 和 检 验 使 用“FindAllMarkers”函数确定特征基因对于细胞类型鉴定，对相同细胞类型的簇进行re-tSNE分析、基于图的聚类和标记物分析。2.4. 伪时间分析使用具有DDRTree和默认参数的Monocle 2yy在Monocle评估之前，我们从Seurat聚类结果中选择标记基因，并确定通过过滤的细胞的原始表达计数。根据伪时间分析，进行分支表达式分析建模（BEAM）测试。然后以伪时间顺序构建多个轨迹，以清楚地评估分支和线性分化。理论上，在轨迹图中，位于相同或相邻分支上的细胞比位于相邻分支上的细胞在层次上更相关。2.5. 细胞通信评估使用CellPhoneDB和公开可用的受体、配体及其相互作用的数据库进行细胞-细胞通信分子的系统评估该程序之后是在不同时间点的膜 、 分 泌 和 外 周 蛋 白 质 簇 的 注 释 。 平 均 值 和 细 胞 通 讯 显 著 性（p0.05）根据和www.novelbrain.com。https://satijalab.org/seurat/.yyhttp://cole-trapnell-lab.github.io/monocle-release。表17名COVID-19患者和对照组的临床特征样品患者年龄性共存疾病入组时的疾病严重危重抗病毒治疗出院时疾病严重危重糖皮质激素治疗免疫球蛋白治疗 机械通气ARDS采样时是是ICU录取全病程ARDS是是临床结果症状发作后天数718S1S2R7S3R3M1R1R6M2患者1患者25966男女是是无高血压是是是否否是否是出院回家出院回家患者353男性 高血压严重是的严重是的没有没有是的没有是的出院回家1330624316女性患者4脂肪肝59中度中度是的没有没有没有没有没有出院回家没有女性患者5脂肪肝48中度严重是的没有是的没有没有是（采样后4天）否出院回家没有M3R4R5M4R2N1N2N3N4N5N6患者666男性 没有中度是的中度没有没有没有没有出院回家没有132532325患者762男性 乙型肝炎中度是的中度没有没有没有没有没有没有出院回家对照1控制2控制3控制4控制器5控制6555154556158女女男S1ARDS：急性呼吸窘迫综合征; ICU：重症监护室。否否否否否否Y. Zhang，S.Wang，H.Xia等人工程17（2022）161164图二.最终发展为严重疾病的患者随访期间的胸部计算机断层扫描（CT）成像。在首次症状发作后约6个月进行（a）S1和（b）S2的胸部CT成像;在首次症状发作后约2个月进行（c）S3和（d）M2的胸部CT成像。相互作用和使用Seurat归一化获得的归一化细胞矩阵。2.6. 单细胞调节网络推理和聚类（SCENIC）分析为 了 评 估 转 录 因 子 的 调 控 强 度 ， 我 们 通 过 使 用 RcisTarget 和GRNboost的20000个基序数据库应用单细胞调控网络推断和聚类的工作流程（pySCENIC，v0.9.5）[9]。2.7. QuSAGE分析（基因富集分析）为了表征给定基因组的相对活化，例如途径活化，我们进行了QuSAGE（2.16.1）分析。2.8. 共调节基因分析为了确定基因共调控网络，我们使用Monocle 3的2.9. 统计统计方法的明确描述与相关结果和图例一起提供。2.10. 道德声明本 研 究 已 获 得 浙 江 大 学 附 属 第 一 医 院 伦 理 委 员 会 批 准 （ IIT20200148A）。3. 结果3.1. COVID-19患者和对照者PBMC的单细胞图谱为了分析COVID-19患者和对照组的外周免疫应答，我们对来自患者的总共20个PBMC样本进行了单细胞转录组测序。和健康对照组的人。共对84095个细胞进行测序，每个样本平均4205个细胞（附录A）。总体而言，基于UMAP中簇的最显著差异表达基因（DEG）的23个簇（图1A和1B）显示了UMAP中最显著差异表达基因（DEG）。3（a）和（b）），包括来自单核细胞的那些（S100钙结合蛋白A9（S100A9），人白细胞抗原DRα链（HLA-HLA），分化簇14（CD14）和溶菌酶（LYZ））、CD4+T细胞（分化簇3d（CD3D），分化簇3e（CD3E）和分化簇4（CD4））、CD8+T细胞（CD3D、CD3E和分化簇8a（CD8A）），B细胞（跨膜4-结构域亚家族A成员1（MS4A1），分化簇19（CD19）和分化簇79a（CD79A）），浆细胞（肿瘤坏死因子受体超家族成员17（TNFRSF17）和CD79A），巨噬细胞（粘附G蛋白偶联受体E1（ADGRE1）），树突状细胞（DC）（分化簇1c（CD1C）、HLA-CD4和C型凝集素结构域家族4成员C（CLEC4C））、自然杀伤（NK）细胞（CD3D、CD3E、自然杀伤细胞颗粒蛋白7（NKG7）和颗粒溶素（GNLY））、红细胞（血红蛋白亚基α1（HBA1）和血红蛋白亚基b（HBB））和巨核细胞（血小板因子4（PF 4）和整合素亚单位a2b（ITGA 2B）），通过聚类分析确定（图3（c））。与对照组相比，我们发现COVID- 19患者的免疫细胞失调，特别是在重症和危重患者中（图1A和1B）。3（b）和（d））。各种免疫细胞类型的比例在不同的组之间差异很大结果表明，COVID-19患者和对照之间主要在单核细胞、CD 8 + T细胞和浆细胞方面存在显著差异（图1A和1B）。3（a）、（b）和（d））。我们观察到，与对照组相比，COVID-19患者的单核细胞比例显著增加，恢复期缩短，这表明循环单核细胞可能在COVID-19的发病机制中发挥重要作用。与对照组相比，COVID-19患者的CD 8+T细胞数量减少，特别是在严重感染或危重病例中，这可能表明COVID-19患者的免疫细胞耗竭我们也注意到大部分免疫细胞类型在恢复期内恢复，这表明免疫力可能在恢复期内恢复，COVID-19对免疫细胞的影响并非不可逆转。尽管在我们的研究中，严重感染或危重患者中的单核细胞的量与中度感染病例中的单核细胞的量相比没有显著差异，但UMAP证明单核细胞在严重感染或危重组中被强烈重塑（图1A和1B）。3（a）和（b））。3.2. COVID-19严重感染或危重患者中单核细胞的不同亚群为了揭示COVID-19患者和对照组中单核细胞的特征，我们鉴定了详细的单核细胞亚型。使用re-tSNE分析对定义为单核细胞的簇进行分类Mono 0-11）。这12个簇进一步注释为Mono 0（双调蛋白（AREG）、表皮调节蛋白（EREG）、β-内酰胺酶（RETN）、免疫球蛋白j恒定（IGKC）和白细胞介素-18（IL-18）），Mono 5（AREG、EREG、IGKC、IL-18和干扰素α-诱导的pro-蛋白27（IFI 27））、Mono 1、Mono 4、Mono 11、Mono 6（趋化因子（Y. Zhang，S.Wang，H.Xia等人工程17（2022）161165图三.来自COVID-19患者和对照组的PBMC单细胞图谱。(a)来自具有不同疾病严重程度水平的患者和对照的所有20个PBMC样品的UMAP。（b）不同组的UMAP，即重度/危重（S）、中度（M）、恢复期/恢复期（R）（Rm代表从中度条件的恢复期，Rs代表从重度/危重条件的恢复期）和对照/正常（N）组。（c）不同类型免疫细胞的差异基因热图（d）各组中不同免疫细胞的比例X轴对应于每组，Y轴对应于每个样品中每种细胞类型的比例;使用Wilcoxon秩和检验计算p值（p0.05视为显著）。（IFI 6和IFI 27），Mono 3（IGKC，HLA-DQA1和IFI 6），Mono 7（RETN），和Mono 8（RETN，IGKC和IFI6）（图4（a）和图附录A中的S1）。我们发现亚单核细胞的组成在不同组之间显著不同（图4（b））。我们计算了COVID-19患者单核细胞中亚单核细胞的相对百分比，发现S组中循环单核细胞的多样性显著降低，与M、R和N组一致（附录A中的图S2）。整个S组（即，S1、S2和S3）主要含有Mono 0和Mono 5。此外，样品M2-在中度期间从后来发展为严重疾病的前严重患者5中采集的样品-也主要含有Mono 0和Mono 5（图S2）。M2样品的单核细胞的UMAP与S组中的样品的UMAP相似（图1B）。附录A中的S3）。除了Mono 0和Mono 5之外，样品S1、S2、S3和M2几乎没有其他集群在循环中。此外，我们注意到簇Mono 0和Mono 5仅存在于样本S1、S2、S3和S4中。M2，来自患有或最终发展为重度/危重疾病的患者。因此，Mono 0和Mono 5被认为是严重感染特异性的亚单核细胞或严重疾病的特异性指标。3.3. 严重疾病特异性亚单核细胞Mono 0和Mono 5我们进一步研究了可能导致COVID-19恶化的严重疾病特异性集群Mono 0和Mono 5为了进一步描述Mono 0和Mono 5的功能谱，我们在这些亚群中进行了DEG分析和基因本体（GO）分析。结果显示，Mono 0和Mono 5均特异性高表达促纤维化基因AREG、EREG、具有血栓反应蛋白基序的去整合素和金属蛋白酶2（ADAMTS 2）和细胞因子IL-18 基因（图4（c））。IL-18被认为是Y. Zhang，S.Wang，H.Xia等人工程17（2022）161166见图4。单核细胞簇特征的变化。(a)来自具有不同疾病严重程度水平的患者和来自对照的单核细胞的UMAP。(b)不同群体的UMAP。（c）在Mono 0和Mono 5细胞中具有高表达的基因的Violin图谱（d）Mono 0细胞中AREG和EREG的富集途径（e）Mono 5细胞中AREG和EREG的富集途径CDKN 1A：细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A基因;HBEGF：肝素结合表皮生长因子（EGF）样生长因子基因;PIK 3R：磷酸肌醇-3-激酶调节基因;PAK：p21蛋白（Cdc 42/Rac）激活激酶基因;NCK：NCK衔接蛋白基因;ARAF：A-Raf原癌基因;ELK 1：E26转化特异性转录因子基因;GSK 3B：糖原合成酶激酶3b基因（v-ras）癌基因同源物;ABL：ABL原癌基因;HRAS：Harvey大鼠肉瘤病毒癌基因同源物;RAF 1：Raf-1原癌基因;MTOR：雷帕霉素基因的机制靶点;MAPK：丝裂原活化蛋白激酶基因;STAT 5 B：信号转导和转录激活因子5 B基因;EIF 4 EBP 1：真核翻译起始因子4 E结合蛋白1基因;NRG：神经调节蛋白基因; CAMK 2B：钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II b基因; BAD：BCL 2相关细胞死亡基因激动剂; BTC：β细胞素基因; CBLC：Cbl原癌基因C; SHC（含Src同源2结构域）转化蛋白基因; CAMK 2A：钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II a基因; EGF：表皮生长因子基因; GAB 1：GRB 2相关结合蛋白1基因; RPS6KB 2：核糖体蛋白S6激酶70 kDa多肽2基因; PIK3CA：磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亚基a基因; BRAF：B-Raf原癌基因; MYC：v-myc禽骨髓细胞瘤病病毒癌基因同源物; TGFA：转化生长因子a基因; AKT3：v-akt鼠胸腺瘤病毒癌基因同源物3; CBLB：Cbl原癌基因B; PIK3CB：磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亚基b基因; PTK2：蛋白酪氨酸激酶2基因; PIK3CG：磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亚基c基因; SOS1：无七同源物1之子（果蝇）基因; PIK3CD：磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亚基D基因; CAMK 2D：钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II D基因;CRKL：v-crk禽肉瘤病毒CT10癌基因同源物样; MAP2K7：丝裂原活化蛋白激酶7基因; KRAS：Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物。巨噬细胞活化综合征（MAS）[10]。此外，Mono 0亚型高表达激素基因RETN。京都基因和基因组百科全书（KEGG）途径分析显示，一个显着丰富的成红细胞白血病病毒癌基因同源物（ErbB）信号通路，它可以被激活，通过AREG和EREG与表皮生长因子受体（EGFR）的结合来调节，并且已经证实其与SARS患者中的纤维化相关（图1A和1B）。4（d）和（e））。此外，我们研究中所有在疾病期间具有严重疾病特异性簇Mono 0和Mono 5的患者，Y. Zhang，S.Wang，H.Xia等人工程17（2022）161167在随访期间发生了肺纤维化（图2）。我们推测Mono 0和Mono 5细胞与纤维化有关，并在严重病例中引起炎症使用SCENIC，我们发现AREG和EREG由转录因子激活转录因子3（ATF 3）、Jun二聚化蛋白2（JDP 2）、具有ZNF结构域的正调控结构域I蛋白（PRDM 1）和同源框A5（HOXA 5）的上调驱动;发现ADAMTS 2由ATF 3、PRDM 1和干扰素调控因子1（IRF 1）驱动;发现RETN由Jun原癌基因（JUN）驱动（图11）。 S1（c））。3.4. 单核细胞亚群为了研究单核细胞的类型和状态如何相互关联以及单核细胞如何从中度发展到重度/危重或从重度/危重发展到恢复条件，我们进行了伪时间分析以检查单核细胞如附录A中图5（a）和图S4所示，下降轨迹由正常、恢复和中度病例中的单核细胞亚群组成，而上升轨迹由严重感染或危重病例中的单核细胞亚群（Mono 0和Mono 5）组成，这反映了单核细胞恶化的过程。我们主要集中于通过轨迹分析确定单核细胞亚群从正常、恢复和中度病例到严重感染或危重病例的过渡过程中的基因表达模式我们进一步根据轨迹图构建了基因热图，以确定基因在单核细胞退化过程中的变化。基于观察到的变化，将基因分为三组;上调和下调的途径列于图1中。 5（b）. 沿着该轨迹，从相对正常的单核细胞簇到严重疾病特异性簇（Mono 0和Mono 5），糖酵解/糖异生、HIF-1信号传导途径、肿瘤坏死因子（TNF）信号传导和ErbB信号传导上调，而抗原加工和呈递、吞噬作用和3.5. Mono 0和Mono 5的比例可能与疾病的严重程度有关S1、S2、S3和M2的单核细胞主要由Mono 0和Mono 5两种细胞群组成，但重症病例的和来自重症病例的样品S2，而Mono 5在来自重症前病例的样品M2中占主导地位。重症感染和危重症患者的Mono 0/Mono 5比值与重症前的比值相反 该比率从严重病例前到严重感染和危重患者增加，并且在危重病例中最高（图 S2），这表明Mono 0和Mono 5的比例增加可能是感染患者临床状况的标志。4. 讨论单核细胞在COVID-19的致病性和进展中起着至关重要的作用因此，探索单核细胞参与严重疾病的潜在机制对于更好地理解COVID-19和发现新的治疗靶点可能是有价值的在这项研究中，我们对严重和危重的COVID-19患者的单核细胞进行了深入的表型分析，并使用scRNA-Seq将单核细胞谱与中度和恢复期COVID-19患者以及对照组的我们发现，在重症和危重COVID-19患者中，单核细胞显著重塑，单核细胞百分比增加，多样性严重降低。重要的是，我们发现了两种新的严重疾病特异性单核细胞亚群，即Mono 0和Mono 5，它们可能与严重/危重的COVID-19疾病有关值得注意的是，在患者进展为严重病例之前获得的样品显示出与严重/危重患者相似的单核细胞图谱，这表明单核细胞在进展为严重/危重病症之前经历严重的这一发现证实了单核细胞参与了COVID-19的恶化，这在另一项研究中已有报道[2]。此外，Mono 0和Mono 5存在于重度/危重症患者和后来发展为重度疾病的中度感染患者中;然而，它们不存在于恢复组、其他3例未发展为重度疾病的中度感染患者或对照组中。这些发现表明，这两种新的单核细胞亚群参与了进展为严重疾病的发病机制，并可用作预测COVID-19患者严重疾病的潜在早期标志物我们进一步定义了两种特异性单核细胞，Mono 0和Mono 2。Mono 5，用于COVID-19重症或危重症患者。发现Mono 0和Mono 5特别表达AREG和EREG，并且发现ErbB信号传导途径在GO途径分析中鲁棒AREG和EREG图五、单核细胞亚群的伪时间分析（a）单核细胞亚群的伪时间（b）在假时间中不同单核细胞亚群中差异性上调和下调的途径Fcc R：免疫球蛋白G受体家族; NOD：核苷酸寡聚化结构域;RIG-I：视黄酸诱导基因I; FoxO：叉头盒O; cGMP：环鸟苷一磷酸; PKG：cGMP依赖性蛋白激酶; NF-jB：核因子-jB。Y. Zhang，S.Wang，H.Xia等人工程17（2022）161168在伤口愈合期间迅速诱导表达[11，12]，从而激活EGFR途径（在人体中称为ErbB），以促进感染诱导的组织损伤后的修复和体内平衡。一旦受损组织得到修复，伤口愈合反应就会下调[13]。然而，过度炎症或持续性损伤（如严重COVID-19患者）会使伤口愈合反应失调，导致不受控制的肺修复机制，包括不受限制的肌成纤维细胞分化和过度胶原沉积，并导致瘢痕形成、纤维化和器官功能受损[13纤维化类似于不容易解决的增生或异常愈合反应[16]。EGFR信号传导已被证明是损伤诱导的肺纤维化的关键途径[17]，例如SARS[13]。基于这些发现以及SARS-CoV-2和SARS-CoV-1之间的相似性所有Mono 0和Mono 5的患者在我们研究的随访期间均发现肺纤维化，这进一步支持了我们的假设。肺纤维化可能是COVID-19的主要长期并发症，导致慢性呼吸困难、生活质量下降和沉重负担。因此，迫切需要对纤维化进行有效的干预。我们的研究结果可能会提供一个更好的理解纤维化的机制，以及肺纤维化的早期干预的目标。此外，Mono 0和Mono 5分泌IL-18，与其他Mono-18不同，细胞亚群。IL-18主要由单核细胞和巨噬细胞分泌，以响应有害刺激[18，19]，如SARS-CoV-2感染，并在免疫应答和肺再生中起作用[20血清中高IL-18水平与COVID-19的疾病严重程度和预后不良相关[23]。IL-18参与严重/危重COVID-19患者的细胞因子风暴，导致急性呼吸窘迫综合征（ARDS）[24]。因此，Mono 0和Mono 5可能通过分泌IL- 18参与细胞因子风暴，这可能进一步解释了COVID-19患者的恶化。我们的发现为IL-18抑制剂作为治疗COVID-19的潜在治疗策略提供了证据[25]。此外，我们观察到与其他亚群相比，Mono 0和Mono 5中不同的上调和我们观察到正常单核细胞功能降低，如抗原加工和呈递、吞噬和单核细胞在感染后会发生代谢变化[26，27]，据报道，SARS-CoV-2感染后单核细胞发生了代谢重编程[28，29]。在一项离体研究中，据报道SARS-CoV-2感染可诱导单核细胞中糖酵解的增加-这可通过线粒体活性氧（mtROS）/HIF-1α/糖酵解轴来促进[29]。糖酵解增加促进病毒复制和促炎性细胞因子产生，这进一步解释了细胞因子风暴、T细胞功能障碍和上皮细胞死亡[29，30]。此外，据报道，糖酵解增加是糖尿病患者在COVID-19中患严重疾病的高风险机制的一部分[29]。因此，Mono 0和Mono 5的糖酵解增加表明重度/危重患者存在明显的代谢变化，可能是重度疾病的原因。糖酵解可能是治疗COVID-19的靶点。此外，在一项大规模血浆分析中，新生血管的激活与COVID-19的严重程度相关，并被认为在疾病进展中发挥作用[31]。然而，单核细胞中的造血还没有被单独研究，在这个方向上需要更多的研究。然而，我们的研究证实，靶向代谢途径是治疗COVID-19或预防严重疾病的潜在有效方法[29]。此外，我们发现Mono 0和Mono 5亚组之间存在一些差异; Mono0主要见于重度/危重病例，而Mono 5主要见于重度前病例。我们观察到Mono 0与Mono 5的比例Mono 0/Mono5比值可能是重症/危重症患者疾病严重程度的预测因子我们还发现Mono 0表达RETN基因，而Mono 5中没有RETN是一种主要在人类单核细胞和巨噬细胞中产生的脂肪因子[32]。RETN发挥多种作用，包括通过诱导细胞因子如TNF-α、IL-1和IL-6促进炎症反应，并导致胰岛素抵抗[33]。RETN基因已成为与SARS相关的最重要的基因之一[34]。 在COVID-19中，RETN被描述为一种嗜中性粒细胞衍生的效应物和危重疾病的预测因子[35]。然而，尚未描述COVID-19中单核细胞中的RETN此外，患有糖尿病或心血管疾病的个体，与RETN表达增加相关，在COVID-19中发展为严重或危重疾病的风险很高[36，37]。我们推测RETN是这些患者更容易发展为严重疾病的原因之一，我们怀疑RETN在COVID- 19中发挥作用，因为它具有促炎和胰岛素抵抗功能。这项研究有一些局限性。首先，我们研究的样本量--特别是重症前和重症/危重症样本量--很小。由于采样困难，一些患者的样本在疾病的不同时间点不可用。第二，由于抽样的困难，该假设无法得到验证。需要更大样本量的未来研究来证实本研究的观察结果。第三，我们的研究缺乏其他原因导致ARDS的患者对照组，如流感，这对于更好地理解COVID-19的特异性至关重要。总之，在我们的研究中，发现单核细胞被强烈地重新编程，并且在患有COVID-19的重症前和重症/危重症患者中鉴定了两种新的重症疾病特异性单核细胞亚群。我们认为，这两个新的亚群是严重疾病的潜在预测因子，并表现出促纤维化和促炎症的特征。此外，两个新的子集群表现出代谢变化。综上所述，我们的发现为COVID-19的严重疾病和治疗靶点提供了潜在的新预测因子我们的研究为更好地理解COVID-19的潜在致病机制提供了资源，并可能促进对COVID-19的进一步研究。致谢本 工 作 得 到 了 国 家 科 技 重 大 专 项 （ 2017ZX10204401001002 ） 、 国 家 重 点 研 发 项 目 （ 2017 ZX 10204 -401001002008）、浙江省重点研发项目（2020 C 03123）、浙江省自然科学基金（LED 20 H19001）的资助。我们感谢所有与会者。我们衷心感谢NovelBio公司的参与，Ltd.的NovelBrain云分析平台对生物信息学分析的支持，并感谢Dr. 王超和张伯的贡献。遵守道德操守准则Yan Zhang，Shuting Wang，He Xia，Jing Guo，Kangxin He，Chenjie Huang，Rui Luo，Yanfei Chen，Kaijin Xu，Hainv Gao，Jifang Sheng，Y. Zhang，S.Wang，H.Xia等人工程17（2022）161169及李兰娟声明彼等并无利益冲突或财务冲突须予披露。附录A.补充数据本文的补充数据可在https://doi.org/10.1016/j.eng.2021.05.009上找到。引用[1] Zhang W，Zhao Y，Zhang F，Wang Q，Li T，Liu Z，et al.抗炎药在严重冠状病毒病患者治疗中的应用2019（COVID-19）：来自中国的临床免疫学家的观点。临床免疫学2020;214：108393。[2] [10] Jafarzadeh A，Chauhan P，Saha B，Jafarzadeh S，Nemati M.单核细胞和巨噬细胞对COVID-19中局部组织炎症和细胞因子风暴的贡献：SARS和MERS的教训，以及潜在的治疗干预措施。Life Sci2020;257：118102.[3] Mehta P ， McAuley DF ， Brown M ， Sanchez E ，Tattersall RS ， Manson JJ;HLH Across Speciality Collaboration，UK. COVID-19：考虑细胞因子风暴综合征和免疫抑制。柳叶刀2020;395（10229）：1033[4] Misharin AV ， Morales-Nebreda L ， Reyfman PA ， Cuda CM ， Walter JM ，McQuattie-PimentelAC ， etal.Monocyte-derivedalveolarmacrophagesdrivelung fibrosis and persistent in the lung over the life span. 实 验 医 学 杂 志2017;214（8）：2387-404。[5] [10] Kapellos TS ，Bonaguro L ， Gemünd I， Reusch N ， Saglam A ， HinkleyER，et al. 主要慢性炎症性疾病中的人单核细胞亚群和表型。免疫学前沿2019;10：2035。[6] 余明，刘英，徐东，张荣，兰玲，徐华.使用连续薄层CT和临床特征预测COVID-19肺炎治疗后出院患者的肺纤维化发展。Korean J Radiol 2020;21（6）：746-55.[7] 韩伟，朱梅，陈军，张军，朱松，李涛，等。肺移植治疗肺结核。晚期COVID-19肺炎的老年患者。Ann Surg 2020;272（1）：e33-4。[8] Guillaumet-Adkins A ， Rodríguez-Esteban G ， Mereu E ， Menu-Lago M ，JaitinDA ， VillanuevaA ， etal.Single-celltranscriptomeconservationincryopreserved cells and tissues. Genome Biol 2017;18（1）：45.[9] Aibar S ， González-Blas CB ， Moerman T ， Huynh-Thu VA ， Imrichova H ，Hulselmans G ， et al. SCENIC ： single-cell regulatory network inferenceandclustering. Nat Methods2017;14（11）：1083-6
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