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红霉素发酵残渣水热处理对土壤抗菌剂耐药性的影响研究
工程15(2022)78研究抗菌剂耐药性-供试品红霉素发酵残渣水热处理3年连续田间应用对土壤耐药基因的韩子明a,b,冯浩迪a,萧鸾a,沈云鹏c,任立人c,邓柳杰c,D.G.Joakim Larssond,Michael Gillingse,Yu Zhanga,b,张宇,Min Yanga,ba中国科学院生态环境科学研究中心环境水化学国家重点实验室,北京100085b中国科学院大学,北京100049c国家抗生素残留无害化处理与资源化利用环境保护工程中心,中国霍尔果斯d生物医学研究所,抗生素耐药性研究中心,哥德堡大学,哥德堡SE-413 46,瑞典澳大利亚研究委员会(ARC)合成生物学卓越中心,麦格理大学科学与工程学院生物科学系,悉尼,新南威尔士州2109,澳大利亚阿提奇莱因福奥文章历史记录:2021年12月15日收到2022年4月23日修订2022年5月24日接受2022年6月11日在线提供保留字:药物制造Resistome抗生素风险评估A B S T R A C T基于发酵的抗生素生产导致具有高回收潜力的丰富的富含营养物的发酵残余物,但是高抗生素残余物浓度限制了其有用性(例如,在土地上用作有机肥料)。本研究考察了红霉素发酵残渣(EFR)的工业化水热处理装置,并对处理后EFR长期土壤施用促进环境抗生素耐药性发展的潜在风险进行了评价。该处理有效地去除了细菌及其DNA,并且实现了高达约98%的红霉素去除率。处理后的EFR作为有机肥连续施用从2018年到2020年的应用,剂量范围从3750到15 000 kg·hm-2,导致土壤中红霉素的亚抑制水平(范围从0.83-然后使用宏基因组鸟枪测序来表征抗生素抗性基因(ARG),移动遗传元件(MGEs)和土壤细菌群落组成土壤ARG丰度和多样性在施用EFR的第一年没有响应,但在施用的第二年和第三年逐渐发生变化与对照组(CK;未施用)相比,大环内酯-林可酰胺-链阳性菌素(MLS)和总ARG相对丰度的最高倍数变化分别为12.59和2.75倍。土壤MGE和分类组成表现出类似的时间趋势的ARG,并出现在驱动ARG增殖增加,所揭示的相关性分析和结构方程模型(SEM)。在EFR应用的第三年,特定的抗草甘膦基因(RNA甲基转移酶基因)的相对丰度显着增加。与MGEs的紧密联系表明,水平基因转移在观察到的ESTs基因富集中发挥了关键作用宏基因组分组结果表明,携带mac基因的宿主的增殖是mac基因(外排泵基因)丰度增加的原因。这项研究表明,亚抑制水平的红霉素在土壤中有累积效应,随着时间的推移,并强调了长期监测的重要性,以评估风险的土壤改良剂与处理过的工业废物。©2022 The Bottoms.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇CC BY-NC-ND许可下的开放获取文章(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)中找到。1. 介绍制药业是抗生素污染的一个来源[1,2]。抗生素耐药基因(ARG)和抗生素-*通讯作者。电子邮件地址:zhangyu@rcees.ac.cn(Y. 张)。环境介质中的耐药细菌(ARB)可以在这种污染引起的抗生素选择压力下得到促进,从而导致加速耐药性发展的风险,从而导致公共卫生风险[3]。除了由抗生素生产产生的废水之外,基于发酵的抗生素生产工艺还导致来自生物发酵工艺的大量副产物,其主要由以下组成:https://doi.org/10.1016/j.eng.2022.05.0112095-8099/©2022 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)。可在ScienceDirect上获得目录列表工程杂志首页:www.elsevier.com/locate/engZ.汉,H. Feng,X. Luan等人工程15(2022)7879微生物生物量、发酵底物和剩余抗生素[4]。抗生素发酵残渣(又称抗生素菌丝体残渣)由于其有机质含量高,抗生素发酵残渣经处理后作为土壤改良剂,对制药工业具有这激发了对能够利用发酵残渣的工业操作红霉素是一种大环内酯类抗生素,常用于人类医学和畜牧业生产,治疗革兰氏阳性致病菌引起的感染[5]。红霉素在环境中具有合理的持久性,在美国污水处理厂的污水污泥中检测到浓度高达(62.8± 5.8)lg·kg-1[6]。此外-注意,红霉素被列入观察名单下的水欧盟框架指令[7],因为其对生态系统健康的潜在风险。尽管由于使用和排泄,地表水中红霉素的水浓度很少或从未超过确定的效应水平,但当应用安全系数时,不能排除增加耐药性的风险不是将红霉素纳入上述观察清单的决定的一部分;然而,考虑到红霉素的最小抑制浓度(MIC)据报道,细菌浓度可降至16lg·mL-1,导致水中的预测无效浓度(PNEC)为1lg·mL-1[8]。无论如何,将影响水平从水生介质转换到固体或半固体介质是具有挑战性的[3]。由于这些潜在的风险,红霉素发酵残渣(EFR)是一个很好的模型,研究的有效性和安全性的工业规模的处理和随后的土壤应用。已经报道了许多种类的发酵抗生素(即,通过微生物发酵产生的抗生素)由于其易于水解的特性,可以通过温度增强的水解从水生介质中去除[9]。最近开发了水热预处理来去除废水中的抗生素,以减轻抗生素生产废水中试和全规模生物处理中抗生素耐药性的传播[10水热处理具有成本相对较低和易于工业规模应用的优点[13];此外,已在实验室规模研究中探索了其从EFR中减少红霉素的能力[14]。然而,对于抗生素制造商来说,在半固体介质如发酵残渣上使用水热处理仍然是 因此,测试工业规模的水热处理EFR作为土壤改良剂应是一个优先事项。减少红霉素浓度处理EFR可能会减少其对土壤微生物的选择压力。盆栽试验发现,施用处理过的EFR后,土壤中红霉素的浓度为300lg·kg-1,但红霉素相关抗性基因(EFRB、EFRC和EFR C)的丰度增加,在孵育49天后[15],同样地,单次土壤施用处理过的EFR不会改变抗性基因的丰度[16]。相比之下,一个多年的博览会-将红霉素10 mg·kg-1直接投加到土壤中,随着时间的推移而增加,表明能够降解抗生素的微生物的增殖[17]。暴露4年后,一些红霉素相关ARG(仅测量了msrE和mphE)富集[18]。这些结果表明,长期,反复红霉素应用对土壤生物和ARG丰度的逐渐累积效应。尽管如此,仍然缺乏对所涉及的微生物机制的全面理解施用经处理的EFR后,土壤中的红霉素浓度往往处于土壤细菌的亚抑制范围(ng/kg-1至lg/kg-1水平)[15,16],并且发现与环境中的抗生素浓度相似,人的活动[19]。残留抗生素可能通过水平基因转移抑制敏感细菌的生长并促进ARG传播[20],从而影响抗生素耐药基因组,从而促进抗生素耐药性进化[21,22]。此外,经处理的EFR中存在的耐药细菌可能会引入土壤,这可能会导致此类风险。因此,为了全面评估用处理过的EFR改良土壤促进抗性进化的风险,①调查长期连续的土地施用,②进行时间序列土壤采样,③对抗生素抗性组和相关决定因素进行系统分析将是有价值的在这项研究中,我们的目的是提供基于实地的证据,EFR在土壤生态系统中的影响,并检查一个现实世界的情况下,涉及处理制药废物。具体目标是:①调查水热处理的EFR和接受不同剂量处理的EFR的改良土壤中剩余的红霉素;②评估随时间推移对土壤ARGs的累积影响;③理清土壤中ARG动态的水平和垂直路径。 为了实现这一点,我们检查了来自红霉素制造商的水热处理的EFR的土壤应用。将处理后的EFR作为有机肥料进行了3年的土壤施用试验,并与有机肥和化肥进行了比较。 工业规模的处理和3年的现场应用的结果是有用的EFR的风险评估和相关的政策制定。2. 材料和方法2.1. 红霉素发酵残渣EFR是红霉素生产过程中的副产物,主要含有无活性的菌丝体残渣、发酵培养基、红霉素和代谢产物。在这项研究中,我们调查了2018年至2020年期间在中国新疆维吾尔自治区的一家制药厂对EFR进行的工业规模处理,该工厂旨在生产经处理的EFR作为土壤有机改良剂。该设施的年处理能力为100 000吨EFR。发酵残余物的工业规模处理中的步骤包括水热处理(160 °C,超过15 min)和喷雾干燥(450 °C,超过5 s)。虽然160 °C是最佳温度,但实际操作温度为130 - 170 °C。于二零二零年,我们在水热处理工序后安装了保温槽,以延长高温处理的时间。在喷雾干燥步骤中,将450 °C的温度保持至少5秒,而整个加热和冷却过程持续至少20分钟。提取原始EFR和刚刚水热处理后的EFR的DNA,并在琼脂糖凝胶上观察,为了进一步评估细菌DNA的潜在剩余量,使用聚合酶链反应(PCR)试图扩增细菌16S核糖体RNA(rRNA)基因。2.2. 处理过的EFR在先前未研究的研究中,对经处理的EFR进行了为期3年(2018-Z.汉,H. Feng,X. Luan等人工程15(2022)7880×××××××××位于中国新疆维吾尔自治区的涡轮油田。种植蚕豆是因为生产抗生素的工厂使用它们作为抗生素生产的发酵培养基在不同地块分别施用农业实际剂量和较高剂量。更具体地说,土地应用实验包括2018年的三个处理:(CK;没有修正案),EFR_L(low剂量,3750 kg·hm-2处理EFR)和EFR_H(高剂量,7500 kg·hm-2处理的EFR ) (附 录 A 中 的 图 S1 ) 。 2019 年 ,处 理 的 EFR 剂 量 加 倍(EFR_L,7500 kg·hm-2处理的EFR; EFR_H,15000 kg·hm-2处理的EFR),以调查实际农业剂量和极高剂量。添加粪肥衍生的肥料和化学肥料作为与经处理的EFR的比较(图1)。 S1和附录A第S1节),因为据报告它们对土壤ARGs有影响[23]。2020年,试点方案与2019年考虑到田间试验的复杂性,我们采用土壤中红霉素浓度代替处理后的EFR剂量作为选择压力水平,以确保不同年份的数据具有可比性。在三个大豆生长阶段收集土壤样品,重复三次:每次施用前、每次施用后(施用后约2周)和收获时(施用后约3个月),持续3年。将每个土壤样品分成两部分,其中一部分转移到冰上的实验室并储存在-20 °C下用于DNA提取和红霉素分析,而另一部分则风干并过筛(2mm)用于其他化学表征。2018年和2019年施用前共采集了27个样品(3个阶段3个处理3个重复); 2019年施用阶段和收获阶段后采集了36个样品(2个阶段6个处理3个重复); 54个样品(3个阶段6个处理)2020年的处理(重复3次)进行预处理,用于进一步的化学表征、DNA提取和测序。更多细节请参见第S1节。2.3. 分析方法使用元素分析仪(Vario MAX cube,Elementar,Germany)来确定经处理的EFR和土壤样品的总碳(TC)和总氮(TN)含量对于红霉素A测量,通过Oasis HLB (6 mL/500 mg; Waters ,USA)进行固相萃取(SPE)程序[24]。使用Acquity UPLC BEHShield RP 18 色谱柱 ( 1.7l m , 2.1 mm 100 mm; Waters )和Waters Micromass XEVO TQ MS,采用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS; Waters)测定红霉素A浓度。更多详细信息见附录A。2.4. 土壤DNA提取及16S rRNA基因扩增测序根 据 制 造 商 的 说 明 书 , 使 用 FastDNA SPIN 试 剂 盒 ( MPBiomedicals,USA)进行土壤的DNA提取,并使用NanoDrop1000分光光度计(ThermoFisher,USA)测量DNA浓度和纯度。 使用引物515F ( 5'-GTGCCAGCMGCCGCGG-3' ) 和 907R ( 5'-CCGTCAATTCMTTTTRAGTTT-3'),使用PCR扩增细菌16 S rRNA基因的V4-高-在广东Magigene生物技术有限公司的Illumina NovaSeq PE 250平台 上 进 行 通 量 测 序 。 有 限 公 司 、 中 国 测 序 数 据 以 登 录 号PRJNA650302保藏在国家生物技术信息中心(NCBI)BioProject数据库中有关16S rRNA基因扩增子测序的更多详细信息,请参见第S1节。2.5. 用于ARG和移动遗传元件(MGE)定量宏基因组测序在Illumina X-ten平台上进行,配对末端为2 150个碱基读取长度,在广东Magigene生物技术有限公司,有限公司、中国每个样品获得超过12Gb的原始读段,并以登录号PRJNA647129保藏在NCBI BioProject数据库在遵循先前公开的方法进行质量控制后[26],将过滤的读数用作ARGs-OAP v2.2的输入,ARGs-OAP v2.2是用于表征和定量来自宏基因组数据集的ARG的管道[27]。通过将ARG丰度标准化为细胞数来计算表示为每个细胞的拷贝数的ARG的相对丰度[27],这是用于将宏基因组数据中的基因拷贝标准化的典型实践[28]。The ‘‘cellnumber” was obtained using the CopyRighter database 使 用 从NCBI核苷酸数据库和质粒数据库[31]收集MGE序列的定制MGE数据库,使用Salmon软件和默认参数[32]定量MGE丰度,表示为每个细胞的拷贝数。有关MGE数据库的更多详细信息,请参见第S1节。2.6. 宏基因组组装和分箱使用具有默认k聚体的MEGAHIT对来自2020年应用阶段和收获阶段后采集的样品的过滤读数进行宏基因组组装[33]。单独组装每个样品以获得来自每个样品的重叠群;然后将这些样品合并并组装在一起用于分组。使用MetaWRAP流水线[34]执行组装的宏基因组测序的分箱,其中MaxBin2用于bin文件[35],Quant_bins模块用于每个宏基因组的丰度。每个样品中的bin。选择高质量的基因组箱(基因组质量=完整性-综合抗生素耐药数据库(CARD箱是从宏基因组测序读数获得的重建的微生物基因组,并提供了将ARG与特定宿主联系起来的可能性[40],尽管ARG与细菌分类群之间的简单相关性分析众所周知是不确定的[41]。尽管如此,当组装具有高度移动基因的基因组时(例如,许多ARG),宏基因组学组装也变得不确定。2.7. 统计分析使用Mann-Whitney U检验或Kruskal-Wallis单因素方差分析(ANOVA)分析非参数分组数据的差异使用主坐标分析(PCoA)通过线性判别分析效应量(LEfSe)分析获得了2020年采集的经治疗EFR修正样本中富集的ARG亚型[43]。对于相关性分析,在ARG和MGE的丰度之间使用Spearman相关性,而在ARG和细菌群落之间使用Mantel检验和Procrustes检验[44,45]。使用AMOS 22构建结构方程模型(SEM),以评价红霉素浓度、细菌群落和MGE对ARG的直接和间接影响,并进行稳健的最大似然评价[46]。要求模型满足多个拟合优度标准,包括非显著性v2检验(P> 0.05)、拟合优度指数(GFI)> 0.90和近似均方根误差(RMSEA)0.08[47]。Z.汉,H. Feng,X. Luan等人工程15(2022)78813. 结果3.1. 工业规模处理的EFR和田间土壤EFR的工业规模处理工艺包括水热处理和喷雾干燥,以去除红霉素并在EFR作为有机肥料应用于土地之前降低含水量2018 - 2020年,红霉素浓度为(1659 ± 202)mg/kg-1干重。在处理过程后显著降低(2018年为(350 ± 12)mg·kg-1干重,2019年为(320 ± 26)mg·kg-1干重,(2020年)。2020年红霉素的去除率达到97. 7%,原因是2020年高温处理的持续时间通过增加保温来通过在琼脂糖凝胶上目测,在水热处理的EFR中不能检测到DNA(图1B)。附录A中的S2)。通过PCR从处理过的EFR中扩增细菌16S rRNA基因的尝试因此,该处理将DNA含量大大降低至不可检测的水平。从2018年到2020年,处理过的EFR被用作土壤施用的有机肥料,而粪肥衍生的肥料和化肥被添加,以与处理过的EFR进行比较(图S1)。与施用粪肥衍生肥料的土壤相比,施用EFR处理的土壤在改良3年后显示出更高的TN和略微升高的碳含量(附录A中的表S1和S2)。在接受EFR处理的土壤中检测到红霉素,浓度范围为0.83-总的来说,接受红霉素的土壤中的红霉素浓度低剂量处理的EFR比高剂量处理的EFR土壤中的EFR低3年中,土壤中红霉素浓度在施用期、收获期和次年施用前3个阶段红霉素在土壤中的含量为1g·kg-1,在2019年和2020年应用前处理的EFR,表明预计3年内的暴露量最小。 在对照土壤或施用粪肥或化肥的土壤中未检测到红霉素,其检测限为0.1lg·kg-1(表S3)。3.2. 施用EFR 3年期间土壤ARGs的逐渐变化进行宏基因组测序以量化接受经处理的EFR或其他肥料的土壤中ARG的2018年和2019年,接受两种剂量处理的EFR的土壤中总ARG的相对丰度稳定,与对照CK无显著差异(值范围为0.103拷贝/细胞至0.123拷贝/细胞;P> 0.05,然而,在2020年申请阶段施用7500kg·hm-2和15000kg·hm- 2 EFR处理的土壤中ARG丰度分别为(0.187± 0.051)拷贝/细胞和(EFR((0.278 ± 0.123)拷贝/细胞)显著高于CK样本((0.101 ±0.003)拷贝/细胞)(图2(a)和附录A表S4;P 0.01,Kruskal-Wallis单因素方差分析)。 虽然有机肥和化肥改良剂增加了土壤ARG的丰度,但处理的EFR的影响大于其他处理(图1)。 2(a)和表S4)。为了澄清与2020年对照相比,接受EFR处理的土壤中哪些ARG亚型变得富集,进行了LEfSe分析结果表明,2020年,在EFR处理的土壤中富集了属于大环内酯-林可酰胺-链阳性菌素(MLS)抗性基因家族的7个基因(ELS(39)、ELSB、ELSF、ELST、macB、mgtA和ole2020年施用EFR处理后,抗性基因MLST、MLSB和macB(高剂量处理组的平均丰度分别为0.055拷贝/细胞、0.009拷贝/细胞和0.005拷贝/细胞)是最丰富的MLS抗性基因(附录A表S5 在2020年施用后的样品中,总ARGs和MLS抗性基因的富集程度显著(图1)。2)的情况。施用高剂量EFR处理的土壤中MLS抗性基因的倍数变化为对照的12.59倍,而总ARGs的倍数变化仅为2.75倍。这一发现表明MLS抗性基因的选择性富集。ARG结构的变化与ARG的变化趋势3 年 来 的 丰 裕 。 使 用 PCoA 绘 制 ARGb 多 样 性 , 并 进 一 步 使 用PERMANOVA检查采样阶段和处理的影响(图3(a))。在2018年和2019年,ARG结构不同之间的三采样阶段(P0.01,PERMANOVA),但经处理EFR的修正导致的影响可忽略不计(P>0.05,PERMANOVA)。然而,在2020年,Fig. 1. 3年(2018年、2019年和2020年)田间施用期间接受EFR处理的土壤中的红霉素浓度。ND:未检出; EFR_L:土壤接收2018年处理的EFR为3750kg·hm-2,或2019年和2020年处理的EFR为7500 kg·hm-2; EFR_H:2018年处理的EFR为7500kg·hm-2,或2019年和2020年处理的EFR为15 000kg·hm-2Z.汉,H. Feng,X. Luan等人工程15(2022)7882图二、在三个采样阶段(施用前,施用后和收获阶段)接受处理过的EFR,粪肥衍生肥料和化肥的土壤中ARG丰度,(a)检测到的精氨酸的总丰度。比较一个阶段内的样品,如果基于Kruskal-Wallis单因素ANOVA彼此没有显著差异,(b)2020年农业和农村发展类土壤亚型的概述根据LEfSe分析,仅显示了在经处理的EFR改良的土壤中富集的亚型MF_L和MF_H分别为施用7500和15000kg·hm-2粪肥的土壤,CF为施用化肥的土壤经EFR处理的土壤的ARG结构与对照土壤的ARG结构表现出明显的差异(图2(a);P 0.05,PERM-方差分析)。此外,为了获得每年各阶段ARG结构的详细信息,对CK内以及CK与处理组之间的Bray-Curtis相似性进行了比较。在2019年收获期、2020年施用期前和2020年施用期后,与CK相比,处理的EFR修正降低了ARG相似性(图3(b);P0.05,综上所述,在3年的试验期内,处理过的EFR被用作有机肥;然而,其对土壤的影响土壤中的ARGs不能立即检测到。直到第二年和第三年(即,2019年的收获阶段和2020年的所有采样时间),ARG丰度和多样性在修正处理和对照处理之间明显不同。3.3. 土壤微生物群落和微生物菌群的动态变化3年治疗EFR应用在3年的实验中,土壤细菌群落和MGEs的丰度和结构进行了评估。在门的水平上,放线菌,拟杆菌,厚壁菌门,Z.汉,H. Feng,X. Luan等人工程15(2022)7883图三. 在三个采样阶段(施用前、施用后和收获阶段)接受EFR处理的土壤中的ARG结构,为期3年(2018年、2019年和2020年)。(a)三年三个采样阶段ARG的PCoA和PERMANOVA(b)基于Mann-Whitney U检验,将样本与“CK内”进行比较n.s.,* 、** 和 * 分别表示P≥0.05、0.05、0.01和0.001变形菌门是土壤中检测到的主要细菌门(图1)。 S3,附录A中的表S8-S10)。细菌群落结构仅受2018年采样阶段的影响,但受2019年和 2020 年 采 样 阶 段 和 经 处 理 的 EFR 应 用 的 影 响 ( 附 录 A 图 S4(a))。对照组和改良组之间的Bray-Curtis相似性在2018年收获阶段后变得显著不同。这些结果表明,在实验中发生的细菌群落的转变早于ARG的转变MGE与ARG的水平转移相关,主要由整合子、转座子、质粒和插入序列组成(详见第S1节)。2018年2019年和2019年,对照土壤和EFR处理土壤的MGE丰度相似(在0.003拷贝/细胞~ 0.009拷贝/细胞之间;P> 0.05,Kruskal-Wallis单因素方差分析)。但到2020年,施用EFR的土壤中MGE丰度高于对照土壤。MGE丰度最高为0.042拷贝/细胞2020年收获期处理的EFR为15 000 kg·hm-2(图S5(a)和附录A表S11)。最丰富MGE为tnpA,其次为IS 91和intI 1(图11)。 S5(b),表S12-S14)。与ARG结构类似,MGE结构仅受2018年和2019年采样阶段的影响,但如PCoA和PERMANOVA结果所示,2020年的采样阶段和经处理的EFR修订均对MGE结构产生影响(图10)。附录A中的S6)。3.4. MGEs、细菌群落和红霉素对ARG动力学2018年,ARG丰度和MGE丰度之间的相关性在统计学上不显著(斯皮尔曼P> 0.05)或2019年(Spearman一些MLS抗性基因(P39、P31B、P31F和P31T)显示与MGE类型广泛相关(P0.05,SpearmanZ.汉,H. Feng,X. Luan等人工程15(2022)7884×相关性);然而,macB、mgtA和oleD与MGE之间的相关性不显著(图4(b))。使用Mantel检验和Procrustes检验定量细菌群落与ARG之间的联系。尽管所有3年的统计差异都很显著,但相关系数(r值)从2018年到2020年变得更高(2018年r分别为2019年、2020年,Mantel检验;r= 0.737、0.729和2018年,2019年和2020年分别为0.922,Procrustes测试)(图。 4(c))。为了全面了解MGE、细菌群落和红霉素对ARG动力学的贡献,对这些变量进行了SEM。2020年,红霉素通过影响细菌群落和MGE影响ARG。ARG仅受细菌群落的限制在2018年,但在2019年和2020年受到细菌群落和MGEs的限制(图1)。 4(d))。总体而言,在连续3年田间施用经处理的EFR期间,MGE、细菌群落和红霉素对ARG动态的贡献越来越大,ARG的解释率从2018年的67. 5%增加到2020年的95.6%(图10)。 4(d))。3.5. 通过宏基因组分箱宏基因组组装和分箱用于探索携带ARG的重叠群和推定的携带ARG的细菌宿主,以确定不同样品中ARG的遗传环境和携带ARG的箱的相对丰度从2020年施用后阶段和收获阶段样品的宏基因组结果中,发现10个重叠群携带MLS抗性基因(macB、macT、macA和macB)。代表性的携带MLS抗性基因的重叠群显示在图5(a)中。Tn3家族转座酶是一种典型的MGE,与MGE基因连锁。抗性基因macA和macB以及三磷酸腺苷(ATP)结合盒(ABC)转运蛋白共同出现在一个重叠群上(图5(a))。值得注意的是,携带MLS抗性基因的叠连群不能从对照样品中回收,表明只有优势基因可以通过基因组组装在叠连群中获得。使用宏基因组分箱方法,将12个箱鉴定为高质量宏基因组组装的基因组(完全性-5污染> 50%),并且通过GTDB-Tk软件鉴定它们的 在 GTDB-Tk 软 件 中 , 它 们 被 分 配 到 Verrucomi-crobia ,Proteobacteria,Bacteroidota和Actinobacteriota中(图1)。 5(b),附录A表S15和S16)。其中,8个库携带MLS抗性基因(macA、macB和oleD),且其在施用EFR的土壤中的相对丰度高于对照。相比之下,没有MLS基因的箱的相对丰度(例如,bin.479和bin.62)在接受处理的EFR玉米的土壤中与对照相比是稳定的或更低的(图11)。 5(b)和表S15)。此外,携带MLS抗性基因的箱的富集导致共现基因如tet A 的富集(图 1A 和1B )。 2( b)和5(b))。4. 讨论EFR的水热处理杀死微生物并降解其DNA。因此,抗生素残留是抗生素发酵液图四、施用EFR 3年期间,ARG对MGE、细菌群落和土壤红霉素的变化(a)在3年(2018年、2019年和2020年)实地研究期间,ARG相对丰度与MGE相对丰度之间的Spearman相关性(b)2020年田间研究中显性MLS抗性基因与MGE类型之间的Spearman相关性仅显示了显著性结果(P0.05)的相关系数(r值)(c)ARG与土壤细菌群落之间的Mantel检验和Procrustes检验(d)红霉素、细菌群落和MGE对3年(2018年、2019年和2020年)田间研究期间土壤ARG变化的贡献,如SEM所示。Z.汉,H. Feng,X. Luan等人工程15(2022)7885作为土壤改良剂。EFR中残留的红霉素在多大程度上促进了细胞的增殖和扩散因此,土壤中抗生素耐药性的研究是EFR安全分布和环境管理的关键问题。在这里,我们进行了,据我们所知,第一次研究使用工业规模的处理EFR作为土壤改良剂多年的土地应用。持续输入的处理EFR导致相对稳定的亚抑制水平的红霉素在土壤中。作为研究设计的结果,我们能够研究经处理的EFR土壤改良剂的长期影响,并了解亚抑制抗生素诱导的抗生素耐药组发展的潜在机制。4.1. EFR处理对土壤ARGs的3年累积效应施用EFR后土壤红霉素浓度与收获时和次年添加前的浓度相比有所下降的红霉素在环境中的转化过程,包括吸附、水解裂解、微生物降解和光化学降解,已得到验证[48]。因此,表面径流、渗透、水解和生物降解可能导致红霉素的损失[17]。然而,有限的损失导致维持lg·kg-1的ery浓度在土壤中的应用3年[19]。土壤ARGs和相关决定因素(MGEs和细菌群落)的特点,在3年内通过高通量测序。这些生物变量对红霉素的反应似乎需要一些时间才能形成。细菌群落结构在第一年(2018年)的收获阶段发生了变化,但ARG和MGE直到第二年(2019年)和第三年(2020年)才分别以可检测的方式发生变化。图2. 3和表S3-S6)。值得注意的是,尽管2018年或2019年经处理的EFR和经处理的EFR改良的土壤中的红霉素浓度高于2020年的浓度(图1)。 1(b)),ARG丰度在2018年或2019年没有显著增加,但在2020年明显增加(图1(b))。 2)的情况。ARG的这种逐渐变化表明,图五. (a)代表性的携带ARG的宏基因组组装重叠群和(b)通过宏基因组分箱方法从2020年施用后阶段和收获阶段的土壤宏基因组测序数据中获得的仅显示高质量宏基因组组装的基因组(完整性Z.汉,H. Feng,X. Luan等人工程15(2022)7886是通过经处理的EFR长期暴露于亚抑制浓度红霉素的累积影响,单年应用实验未揭示这一点。此外,在施用2年粪肥后,未发现对土壤ARGs总丰度的累积效应;合理的解释是,大多数粪肥来源的细菌可能不存在于土壤环境中[49]。在本研究中,大环内酯类ARGs的特异性富集大于其他ARGs。这一发现支持了红霉素的直接选择压力,而不是引入的营养素的间接作用,因为后者不会特异性地富集大环内酯-ARG而不是其他ARG。对不同微生物生态系统(如土壤)的这种持续选择压力可能会导致风险,促进尚未发现的大环内酯类耐药性形式的演变(动员和水平转移),并最终可能在临床上带来额外的挑战[3,50]。4.2. 亚抑制红霉素浓度为了解开亚抑制红霉素浓度下ARG富集的机制,使用宏基因组测序、生物信息学分析和多变量统计。已使用msrE和mphE基因作为标记物评估了红霉素暴露的长期影响[17,18]。在这里,我们试图筛选所有已知的ARG,并揭示ARG增殖的垂直和水平途径在富集的MLS基因中,CCLB、CCLF和CCLT是显性的(图2(b),表S4这些转座酶基因显示出与不同类型的MGE显著相关(图4(b)),并且与Tn3家族转座酶(一种典型的MGE)共同出现在来自宏基因组组装的重叠群中(图5(a))。在从染色体组学数据组装的细菌基因组中未发现该基因(图5(b))。此外,由于分箱方法往往无法重建质粒[41],这些结果暗示,质粒携带有hRP1基因,并在红霉素选择压力下通过hRP1基因转移积累。水平基因转移对传播的主要作用是由以前的工作支持。大多数pET基因最初是从质粒中描述的;例如,pETT发现于pGT633[51,52]和p121 BS[53]中,并且侧翼是IS1216 V[54]。最近,发现大环内酯类显著促进细菌接合效率[55],这进一步支持了本实验中MGE和携带质粒的ARG的潜在富集。外排泵基因macA和macB赋予对由14元(例如,红霉素)和15元内酯[56,57]。根据相关性分析(图4(b))和宏基因组组装(图5(a)),与MGE基因相比,本研究中的macA和macB表现出与MGE的弱连接,并且通常发生在由宏基因组序列组装的细菌基因组上(图5(b))。这些结果表明macA和macB倾向于定位在细菌染色体上,携带mac基因的细菌宿主在红霉素压力下的富集有助于mac基因的富集。一些不赋予MLS抗性的ARG也变得富集(图2(b))。这种现象的一个合理解释是MLS基因和其他基因的共同选择。例如,tetA、macA和macB共同出现在bin. 594中,该bin的富集导致mac基因和tetA的丰度增加(图5(b))。根据多元统计结果,在3年期间,ARG与细菌群落(垂直途径)和MGEs(水平途径)之间的联系逐渐增强(图1和图2)。4(a)和(c)),SEM结果进一步证实了这一趋势(图4)。 4(d))。由于抗生素的亚抑菌浓度不会杀死敏感细菌,但可能只是降低其生长速率[20,58,59],因此这种浓度仍可能使耐药细菌具有竞争优势,从而导致ARG富集此外,亚抑制性抗生素浓度可诱导SOS反应和RpoS调节子,已知这两者均可提高水平基因转移速率,从而增加ARG丰度[20]。总之,水平和垂直路径的综合作用导致了在EFR处理的土壤中,在红霉素的亚抑制浓度下ARGs的大量繁殖。3年在2020年收获阶段,ARG丰度低于施用阶段后一个合理的解释是质粒携带的适应性成本对细菌的繁殖和存活产生了负面影响[60]。在选择压力下,不同的土著细菌群落可能导致不同的ARG变异,不同类型的农业土壤可能会有不同的反应[61]。对EFR影响的进一步研究应考虑土壤类型。4.3. 环境和工程影响土壤改良剂通常每年与土壤混合一次或多次。因此,多年监测和时间序列采样对于土壤改良剂的评估至关重要在本研究中,红霉素在土壤中的降解相对缓慢,与其他一些抗生素如链霉素的降解相一致[9],导致红霉素在3年期间的lg·kg-1水平的存在红霉素持续3年,ARG结构和在第二年和第三年,ARG丰度开始以可检测的方式发生变化我们的研究结果强调,应用频率是一个重要的变量,评价处理EFR土壤改良剂的环境影响此外,其他种类的抗生素发酵残留物、粪肥[62]、活性污泥[63]和再生水[64]也被添加到土壤中,所有这些都含有抗生素。根据我们的研究结果,我们迫切呼吁对上述来源的亚抑制性抗生素的长期影响进行谨慎的检查。出于实际原因,我们的研究对土壤地块的复制有限;因此,更复杂的随机地块设计在未来的评估研究中可能有价值[65]。在农业实践中,在田间水平上,1年内来自有机肥的TN量不应超过250 kg·hm-2[66],处理过的EFR的TN含量约为50 g·kg-1。因此,在这项研究中,高剂量应用治疗的EFR倾向于这是一个非常高的剂量(375-750公斤TN每公顷每年)。实际农业需要可能更接近于本研究采用的低剂量施用,在3年的试验期内,与高剂量施用相比,低剂量施用显示出有限的抗生素抗性发展。长期应用不同剂量的治疗EFR对其风险管理至关重要[65]。我们不能排除第一年给予的较低剂量可能在对耐药基因组无明显影响的情况下发挥作用的可能性。红霉素残留浓度低于本试验的处理后EFR土壤多年施用是否会影响土壤抗性,以及隔年施用是否会减轻其对环境的影响,有待进一步探讨。利用抗生素发酵残留物作为土壤改良剂有利于循环经济和碳中和[67],但也必须仔细考虑这种做法可能带来的风险。热处理有效地消除了与耐药微生物传播相关的风险,这在发酵过程中可能会得到促进Z.汉,H. Feng,X. Luan等人工程15(2022)7887热处理还导致有效去除这些生物体的遗传物质。回收抗生素发酵残留物的工程操作的关键剩余目标是去除残留的抗生素,从而防止这些生物活性剂污染环境。本文采用工业规模的水热法从EFR中去除红霉素.它还增强了蛋白质样聚合物的释放,以更好地利用EFR作为肥料或生物能源[14]。延长高温处理时间可提高红霉素的去除效果。更有效和经济的方法,如固体碱催化剂水热处理[68]和水热碳化[69],是更好去除抗生素的潜在选择。5. 结论发酵残留物是抗生素制药工业的副产品,是抗生素环境污染的一个重要来源,但并不总是受到重视。本研究进行了多年的调查,工业规模的EFR处理和原位土地应用处理EFR。EFR对红霉素的去除率高达97.7%,连续处理EFR可用于红霉素的生物降解。在3年的研究中,阳离子在土壤中保持亚抑制(lg/kg-1水平)红霉素浓度土地基于时间序列采样,施用高剂量的经处理的EFR对土壤ARGs表现出累积影响,实际农业剂量的影响弱于高剂量。此外,对宏基因组序列的系统数据挖掘显示,水平和垂直传播途径分别参与了增加的pcr基因和mac基因丰度。这些研究结果对抗生素发酵残渣和其他含抗生素废弃物的风险评价和环境管理具有重要意义。确认本研究获得了国家自然科学基金(321410
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