福尔马林固定组织中基因组空间表达谱分析技术

PDF格式 | 1.94MB | 更新于2025-01-16 | 55 浏览量 | 举报

技术

福尔马林固定组织中全基因组空间表达谱分

析

图形摘要

亮点

福尔马林固定组织的解交联使得能够进行全转录组

mRNA

分析

FFPE

小鼠脑数据的分子概况概括了已知的解剖结构

分子标记与卵巢癌

对

SARS-CoV-2

感染肺部的分析揭示了感染后的免疫反应

作者

Eva Gracia Villacampa，Ludvig

Larsson，Reza Mirzazadeh，.，Ali

Mirazimi，Joseph Carlson，Joakim

Lundeberg

对应

joakim. scilifelab.se

在简介

Gracia Villacampa et al.

开发一种方法，

使用空间条形码载玻片并基于寡聚

（

）

mRNA

捕获，对

FFPE

和

PFA

固定

的组织切片中的

mRNA

进行空间分析。

Gracia Villacampa等人，2021，细胞基因组学1，100065

2021

年

月

日

作者。

https://doi.org/10.1016/j.xgen.2021.100065

会

开放获取

技术

福尔马林固定组织中

全基因组空间表达

谱分析

Eva Gracia Villacampa

，

1，13

Ludvig Larsson

，

1，13

Reza Mirzazadeh

，

1，14

Linda Kvastad

，

1，14

Alma Andersson

，

张海波、约瑟夫

·M·

莫尔兹伯里、卡琳

索菲亚

阿佩尔伯格

、

努里亚

蒙塞拉特、卡琳

·索菲亚·

阿佩尔伯格、卡琳

索菲亚

蒙

塞拉

特

彭宁格，

9，10

沃尔夫冈米斯巴赫，

阿里米拉齐米，

3，5，12

约瑟夫卡尔森，

和

Joakim Lundeberg

1，15，

瑞典斯德哥尔摩17165 KTH皇家理工学院化学、生物技术和健康工程科学学院基因技术系，生命科学实验室

肿瘤病理学系，卡罗林斯卡医学院，17176斯德哥尔摩，瑞典

Karolinska研究所和Karolinska大学医院临床微生物学单位实验室医学部，17177斯德哥尔摩，

瑞典

病理学和细胞学系，卡罗林斯卡大学医院，17176斯德哥尔摩，瑞典

瑞典公共卫生署，17182，索尔纳，瑞典

Pluripotency for Organ Regeneration，Institute for Bioengineering of Catalonia（IBEC），The Barcelona Institute of Technology

（BIST），巴塞罗那，西班牙

加泰罗尼亚研究和高级研究所，西班牙巴塞罗那

多伦多大学麻醉、医学和生理学系，基南生物医学科学研究中心，Unity Health

天气-多伦多，加拿大

Department of Medical Genetics，Life Sciences Institute，University of British Columbia，V6T 1Z3 Vancouver，BC，Canada

奥地利科学院分子生物技术研究所，Bohr-Gasse博士3，1030 Vienna，Austria

法兰克福大学医院输血医学研究所第二医疗诊所止血和血友病中心

60590 Frankfurt am Main，德国

国家兽医研究所，751 89乌普萨拉，瑞典

这些作者贡献相等

这些作者贡献

相等

主要联系人

* 通信： joakim.

scilifelab.sehttps://doi.org/10.1016/j.xgen.2021.1

00065

总结

福尔马林固定石蜡包埋（

FFPE

）是最广泛的长期组织保存方法。在这里，我们报告了一个程序，以执行全

基因组的空间分析的

mRNA

在

FFPE

固定的组织切片，使用完善的，商业上可获得的方法成像和空间条形

码，使用载玻片点样条码寡（

）探针捕获的

端的

mRNA

分子在组织切片。我们应用这种方法从小鼠大

脑的冠状面的表达谱和细胞类型映射我们还分析了两个卵巢癌肉瘤样本中转录组签名的空间组成，举例说

明该方法最后，我们证明了该检测方法的适用性，以表征人类肺和肾脏类器官和感染

SARS-CoV-2

的人类

肺活检标本。我们预计

FFPE

生物标本中的全基因组空间基因表达谱将用于生物库样本的回顾性分析，这将

有助于生物过程和生物标志物发现的纵向研究。

介绍

几十年来，福尔马林固定和石蜡包埋（FFPE）一直是临床生物

标本组织保存的首选方法FFPE比基于冷冻的方法更便宜且更容

易使用，并且提供了高度的形态细节再现。

因此，生物库中有

大量FFPE标本可随时用于遗传学研究，可用于广泛的纵向研

究。

对大型患者队列的研究。然而，福尔马林固定由于福尔马林介导

的链切割和RNA与其他生物分子之间交联加合物的形成而负面影

响核酸完整性和可及性。

最近，已经开发了几种用于组织切片的空间分析的方法（最近

由Asp等人综述）

）并且可以广泛地表征为：（1）基于杂交的

方法，其需要预先存在的探针设计靶的知识，和（2）基于测序

的方法，其

CellGenomics 1，100065，December 8，2021

$2021作者。1

这是CC BY许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。

会

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技术

Cell Genomics1，100065，2021

允许在被空间分析的组织中无偏的mRNA聚（A）捕获。基于测

序的分析的开创性方法之一是空间转录组学，

当应用于新鲜冷

冻（FF）组织切片以探索和分析器官发育和疾病中的转录组学

景观时，该方法已反复证明其价值。

FFPE样品

、

的基于灵敏测序的空间转录组学方法的开发受到

福尔马林诱导的mRNA分子交联和降解所引起的技术挑战的阻

碍。已经开发了全基因组定量策略以应用于大量FFPE样品，

，

其通常涉及核糖体消耗或使用寡核苷酸探针杂交的靶向捕获以

富集片段化mRNA;然而，目前没有可用于FFPE组织样品的无在

这项研究中，我们提出了一种基于商业平台的方案，适用于从

FFPE组织切片中恢复空间分辨的mRNA谱。我们应用该方案来

表征来自小鼠脑、人类类器官、临床癌症样品和来自感染严重急

性呼吸综合征（SARS）-CoV-2的患者的肺组织的FFPE组织我

们的结果表明，所提出的协议是通用的，可以恢复全基因组信息

从不同的组织类型保存在不同的条件下。FFPE一直是生物库中

临床样本储存的金标准，我们预计我们的发现将促进对存档生物

标本的研究，以更好地表征疾病进展、免疫反应和器官发育中关

键事件的分子基础。

设计

通过

原位

去除石蜡和交联，将组织切片置于条形码载玻片上，实

现用于空间FFPE分析的固定mRNA的回收（图1）。用于FFPE

样品的方案在几个方面与已建立的FF工作流程

不同，以允许交

联逆转以及尺寸选择和片段化过程的变化。引入某些步骤以适应

FFPE样品的特殊性，而其他变化与数据产量优化有关（参见

STAR方法）。

首先，将漂浮的FFPE组织切片附着到空间条形码化的载玻片

上，在烘箱中干燥，然后通过在二甲苯和乙醇中连续浸渍脱蜡考

虑到FFPE组织已经用交联剂固定了较长时间（约24 h），我们

推断形态将得到保留，因此省略了固定步骤。组织切片用苏木精

和伊红（HE）染色并在高分辨率显微镜下成像。接下来，将组

织切片用胶原酶预透化，然后进行交联逆转。胶原酶被包括在早

期的空间转录组学方案中，以促进组织-

细胞去除和mRNA捕获，因为已知其有助于细胞外基质结构的破

坏。

通过在70 ℃下用pH 8.0的Tris-EDTA缓冲液热诱导修复

的pH

8.0先前已经报道了防止不希望的副反应，例如pH依赖性RNA水

解。

[16]

此外，有人提出了三羟甲基氨基甲烷和甲醛分子之间的淬

灭机制。

通过研究Tris-EDTA（TE）缓冲液组成和pH的变化，

使用储存在6

℃

的结肠癌FFPE组织优化去交联（图S1）。我们发

现，没有一种组合物在荧光标记的cDNA信号中呈现任何剧烈变

化，并得出结论，所有组合物都产生可接受的信号。通过额外的

组织优化（TO）实验评价了我们认为具有稍好的cDNA信号的两

种条件（图S2A）。接下来，为了获得定量数据，使用这些条件

制备cDNA文库。再次，测序数据没有显示出任何重大差异，其

中似乎最佳的组成是TE缓冲液pH 8.0（表S1）。

交联逆转后，组织切片进行酶促透化。建议根据组织类型优化

透化时间，因为可能影响mRNA可及性的特定特征在组织间存在

差异。这通常通过TO测定来确定，如其他地方所述。在我们的

实验中，我们另外评估了PBS作为可能的解交联剂（图S2B）。

在小鼠脑组织中，在30 min的透化持续时间下确定最佳信号（图

S2B），PBS的性能不优于TE缓冲液pH 8.0。

接下来，如STAR方法中所述，用表S2中给出的实验条件和质

量度量预测序来自不同组织的测序文库。

基于

TSO

的质量控制（

）测定

在这项工作中，我们开发了一种测定法，用于在文库制备之前评

估样品的非交联聚腺苷酸化RNA分子的空间可及性（图S3）。

在我们的方法设计过程的开始，我们依赖于 RNA 完整性数

（RIN）和分布值200（DV200）计算总RNA提取，以衡量FFPE

块是否有足够的RNA质量进行分析。然而，这些指标对测序数据

质量的预测能力低于预期。鉴定了一些差异：一组临床癌肉瘤样

品具有相对低的RIN值（观察到的：2.3我们研究的第一个FFPE

小鼠脑样品，我们从中获得了高转录组覆盖率用于我们的分析，

具有65%的DV200值然而，具有高达68%的DV200的FFPE块

（其后来显示已固定极长时间（5天，通常为24小时））产生低

复杂性的文库（表S3）。这些质量测量基于核糖体RNA完整性

或总RNA，并且不考虑甲醛处理引起的mRNA的聚（A）尾的可

能损失。此外，这些都是散装质量

Cell Genomics1，100065，2021

会

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图2. FFPE小鼠脑组织的分析

(A)

海马区突出显示的冠状面H E图像（左）。海马区的放大视图（右）。突出显示3个解剖结构（右上）：视野1锥体层（CA 1 sp）、视野3锥体层（CA 3sp）

和齿状回（DG-sg）。来自无监督分析（右下）的3个选定聚类（13、14和15）验证了由分子特征和神经解剖学定义的结构之间的对应关系。

(B)

具有（A）中突出显示的簇13、14和15的UMAP嵌入。

(C)

点图显示了（A）和（B）中每个海马簇的前5个最显著的标志物基因。

(D)

(i)基因-基因散点图显示FFPE数据和从新鲜冷冻组织获得的数据集之间的log 10转换基因计数（Pearson相关性评分为0.95，p值为2.23 10

- 16

）。（ii和iii）手

动配准到Allen Brain Atlas的冠状小鼠脑组织切片的HE图像（ii）新鲜冷冻和（iii）FFPE组织。右叶代表艾伦脑图谱定义的11个解剖区域的地图。(iv)热图显示了

FFPE和为11个解剖区域中的每个区域计算的新鲜冷冻数据集之间的一致性。

(E)

跨解剖区域的斑点组成显示为相对比例。

(F)

使用细胞类型映射方法

立体镜将

来自同皮质的5种神经元细胞类型亚类映射到FFPE冠状切片。每个点通过饼图说明，该饼图显示5种细胞类型亚类的相对组

成细胞类型亚类缩写：L2/3 IT CTX 1，端脑内大脑皮质层2/3;L4/5 IT CTX，端脑内大脑皮质层4/5; L5 IT CTX，端脑内大脑皮质层5; L5 PT CTX，大脑皮质层5

锥体束; L 6 CT CTX，皮质丘脑的大脑皮质层6。

(G)

在UMAP空间中显示的5种细胞类型亚类的比例值的可视化（与F中所有5种细胞类型都富集在大脑皮层（CTX）中的簇

结果

FFPE

空间转录组学数据概括了小鼠脑

在各种项目中，使用多基因组学方法结合详细的神经解剖图对小

鼠大脑进行了广泛的表征这些努力使小鼠脑成为评估和探索

空间转录组学应用于FFPE组织。小鼠脑的解剖结构已经基于来

自Allen Brain Atlas

、

的冠状参考中的HE染色组织切片的组织

学特征进行了详细注释，其中每100m m收集的132个组织切片沿

着前后轴跨越整个小鼠脑。使用这个解剖学参考，我们可以确定

收集的组织切片沿前后轴的位置。

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cpongm

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