技术福尔马林固定组织中全基因组空间表达谱分析图形摘要亮点福尔马林固定组织的解交联使得能够进行全转录组mRNA分析dFFPE小鼠脑数据的分子概况概括了已知的解剖结构d分子标记与卵巢癌d对SARS-CoV-2感染肺部的分析揭示了感染后的免疫反应作者Eva Gracia Villacampa，LudvigLarsson，Reza Mirzazadeh，.，AliMirazimi，Joseph Carlson，JoakimLundeberg对应joakim. scilifelab.se在简介Gracia Villacampa et al. 开发一种方法，使用空间条形码载玻片并基于寡聚（dT）mRNA捕获，对FFPE和PFA固定的组织切片中的mRNA进行空间分析。Gracia Villacampa等人，2021，细胞基因组学1，1000652021年12月8日-作者。https://doi.org/10.1016/j.xgen.2021.100065会会开放获取技术福尔马林固定组织中全基因组空间表达谱分析Eva Gracia Villacampa，1，13Ludvig Larsson，1，13Reza Mirzazadeh，1，14Linda Kvastad，1，14Alma Andersson，1张海波、约瑟夫·M·莫尔兹伯里、卡琳·索菲亚·阿佩尔伯格、努里亚·蒙塞拉特、卡琳·索菲亚·阿佩尔伯格、卡琳·索菲亚·蒙塞拉特彭宁格，9，10沃尔夫冈米斯巴赫，11阿里米拉齐米，3，5，12约瑟夫卡尔森，2和Joakim Lundeberg1，15，*1瑞典斯德哥尔摩17165 KTH皇家理工学院化学、生物技术和健康工程科学学院基因技术系，生命科学实验室2肿瘤病理学系，卡罗林斯卡医学院，17176斯德哥尔摩，瑞典3.Karolinska研究所和Karolinska大学医院临床微生物学单位实验室医学部，17177斯德哥尔摩，瑞典4病理学和细胞学系，卡罗林斯卡大学医院，17176斯德哥尔摩，瑞典5瑞典公共卫生署，17182，索尔纳，瑞典6Pluripotency for Organ Regeneration，Institute for Bioengineering of Catalonia（IBEC），The Barcelona Institute of Technology（BIST），巴塞罗那，西班牙7加泰罗尼亚研究和高级研究所，西班牙巴塞罗那8多伦多大学麻醉、医学和生理学系，基南生物医学科学研究中心，Unity Health天气-多伦多，加拿大9Department of Medical Genetics，Life Sciences Institute，University of British Columbia，V6T 1Z3 Vancouver，BC，Canada10奥地利科学院分子生物技术研究所，Bohr-Gasse博士3，1030 Vienna，Austria11法兰克福大学医院输血医学研究所第二医疗诊所止血和血友病中心60590 Frankfurt am Main，德国12国家兽医研究所，751 89乌普萨拉，瑞典13这些作者贡献相等14这些作者贡献相等15主要联系人*通信：joakim.scilifelab.sehttps://doi.org/10.1016/j.xgen.2021.100065总结福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）是最广泛的长期组织保存方法。在这里，我们报告了一个程序，以执行全基因组的空间分析的mRNA在FFPE固定的组织切片，使用完善的，商业上可获得的方法成像和空间条形码，使用载玻片点样条码寡（dT）探针捕获的30端的mRNA分子在组织切片。我们应用这种方法从小鼠大脑的冠状面的表达谱和细胞类型映射我们还分析了两个卵巢癌肉瘤样本中转录组签名的空间组成，举例说明该方法最后，我们证明了该检测方法的适用性，以表征人类肺和肾脏类器官和感染SARS-CoV-2的人类肺活检标本。我们预计FFPE生物标本中的全基因组空间基因表达谱将用于生物库样本的回顾性分析，这将有助于生物过程和生物标志物发现的纵向研究。介绍几十年来，福尔马林固定和石蜡包埋（FFPE）一直是临床生物标本组织保存的首选方法FFPE比基于冷冻的方法更便宜且更容易使用，并且提供了高度的形态细节再现。1因此，生物库中有大量FFPE标本可随时用于遗传学研究，可用于广泛的纵向研究。对大型患者队列的研究。然而，福尔马林固定由于福尔马林介导的链切割和RNA与其他生物分子之间交联加合物的形成而负面影响核酸完整性和可及性。2最近，已经开发了几种用于组织切片的空间分析的方法（最近由Asp等人综述）3）并且可以广泛地表征为：（1）基于杂交的方法，其需要预先存在的探针设计靶的知识，和（2）基于测序的方法，其CellGenomics 1，100065，December 8，2021 <$2021作者。1这是CC BY许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。会开放获取技术2Cell Genomics1，100065，2021允许在被空间分析的组织中无偏的mRNA聚（A）捕获。基于测序的分析的开创性方法之一是空间转录组学，4当应用于新鲜冷冻（FF）组织切片以探索和分析器官发育和疾病中的转录组学景观时，该方法已反复证明其价值。5FFPE样品9、10的基于灵敏测序的空间转录组学方法的开发受到福尔马林诱导的mRNA分子交联和降解所引起的技术挑战的阻碍。已经开发了全基因组定量策略以应用于大量FFPE样品，11，12其通常涉及核糖体消耗或使用寡核苷酸探针杂交的靶向捕获以富集片段化mRNA;然而，目前没有可用于FFPE组织样品的无在这项研究中，我们提出了一种基于商业平台的方案，适用于从FFPE组织切片中恢复空间分辨的mRNA谱。我们应用该方案来表征来自小鼠脑、人类类器官、临床癌症样品和来自感染严重急性呼吸综合征（SARS）-CoV-2的患者的肺组织的FFPE组织我们的结果表明，所提出的协议是通用的，可以恢复全基因组信息从不同的组织类型保存在不同的条件下。FFPE一直是生物库中临床样本储存的金标准，我们预计我们的发现将促进对存档生物标本的研究，以更好地表征疾病进展、免疫反应和器官发育中关键事件的分子基础。设计通过原位去除石蜡和交联，将组织切片置于条形码载玻片上，实现用于空间FFPE分析的固定mRNA的回收（图1）。用于FFPE样品的方案在几个方面与已建立的FF工作流程13不同，以允许交联逆转以及尺寸选择和片段化过程的变化。引入某些步骤以适应FFPE样品的特殊性，而其他变化与数据产量优化有关（参见STAR方法）。首先，将漂浮的FFPE组织切片附着到空间条形码化的载玻片上，在烘箱中干燥，然后通过在二甲苯和乙醇中连续浸渍脱蜡考虑到FFPE组织已经用交联剂固定了较长时间（约24 h），我们推断形态将得到保留，因此省略了固定步骤。组织切片用苏木精和伊红（HE）染色并在高分辨率显微镜下成像。接下来，将组织切片用胶原酶预透化，然后进行交联逆转。胶原酶被包括在早期的空间转录组学方案中，以促进组织-细胞去除和mRNA捕获，因为已知其有助于细胞外基质结构的破坏。14通过在70 ℃下用pH 8.0的Tris-EDTA缓冲液热诱导修复15的pH8.0先前已经报道了防止不希望的副反应，例如pH依赖性RNA水解。[16]此外，有人提出了三羟甲基氨基甲烷和甲醛分子之间的淬灭机制。2通过研究Tris-EDTA（TE）缓冲液组成和pH的变化，使用储存在6℃的结肠癌FFPE组织优化去交联（图S1）。我们发现，没有一种组合物在荧光标记的cDNA信号中呈现任何剧烈变化，并得出结论，所有组合物都产生可接受的信号。通过额外的组织优化（TO）实验评价了我们认为具有稍好的cDNA信号的两种条件（图S2A）。接下来，为了获得定量数据，使用这些条件制备cDNA文库。再次，测序数据没有显示出任何重大差异，其中似乎最佳的组成是TE缓冲液pH 8.0（表S1）。交联逆转后，组织切片进行酶促透化。建议根据组织类型优化透化时间，因为可能影响mRNA可及性的特定特征在组织间存在差异。这通常通过TO测定来确定，如其他地方所述。在我们的实验中，我们另外评估了PBS作为可能的解交联剂（图S2B）。在小鼠脑组织中，在30 min的透化持续时间下确定最佳信号（图S2B），PBS的性能不优于TE缓冲液pH 8.0。接下来，如STAR方法中所述，用表S2中给出的实验条件和质量度量预测序来自不同组织的测序文库。基于TSO的质量控制（QC）测定在这项工作中，我们开发了一种测定法，用于在文库制备之前评估样品的非交联聚腺苷酸化RNA分子的空间可及性（图S3）。在我们的方法设计过程的开始，我们依赖于RNA完整性数（RIN）和分布值200（DV200）计算总RNA提取，以衡量FFPE块是否有足够的RNA质量进行分析。然而，这些指标对测序数据质量的预测能力低于预期。鉴定了一些差异：一组临床癌肉瘤样品具有相对低的RIN值（观察到的：2.3我们研究的第一个FFPE小鼠脑样品，我们从中获得了高转录组覆盖率用于我们的分析，具有65%的DV200值然而，具有高达68%的DV200的FFPE块（其后来显示已固定极长时间（5天，通常为24小时））产生低复杂性的文库（表S3）。这些质量测量基于核糖体RNA完整性或总RNA，并且不考虑甲醛处理引起的mRNA的聚（A）尾的可能损失。此外，这些都是散装质量Cell Genomics1，100065，2021年12月8日3会开放获取技术图1.采用适应方案的FFPE组织切片中mRNA表达的可视化(A) 将组织切片置于空间基因表达载玻片上按照标准方案对载玻片进行脱蜡（参见STAR方法）。HE染色切片在高分辨率显微镜下成像。通过加热并在pH 8.0的Tris-EDTA缓冲液存在下逆转交联。将组织透化，使得mRNA扩散到条形码化的表面探针并与其寡聚（dT）捕获区杂交通过逆转录合成cDNA链使用与模板转换寡核苷酸（TSO）序列反向互补的用于读取2的定制引物或使用常规Truseq R2引物对成品文库进行测序。(B) 最终结构概述。读段2可以从2个不同的位置开始，这取决于是否使用定制引物进行测序（参见STAR方法）。评估方法不能解释mRNA丰度、可及性和降解的空间差异。进行TO测定，其中荧光信号对应于通过逆转录合成的cDNA链的量和长度，直接解释了这些。我们假设，在FFPE样本的情况下，mRNA链中存在交联可能会阻碍逆转录步骤中cDNA的延伸，从而阻碍模板转换寡核苷酸（TSO）序列的添加。因此，在TO测定中观察到的cDNA信号不一定反映用于FFPE文库制备的可扩增片段的量。TO测定的另一个常见考虑是难以从阵列表面去除组织。剩余的组织会产生自发荧光，在标准TO方案中，转录发生在组织去除之前因此，为了确认不存在组织产生的自体荧光，应在光学显微镜下检查载玻片是否存在细胞碎片。为了解决这些问题，我们设计了一种仅靶向可扩增cDNA的QC测定，即，存在TSO的cDNA分子（图S3）。荧光标记的DNA寡核苷酸被设计成与表面结合的cDNA上的TSO序列杂交，其中荧光信号用作检测可扩增片段的代表该试验（以下称为基于TSO的QC试验）用于评估FFPE组织块子集的RNA的空间可及性。4Cell Genomics1，100065，2021会开放获取技术图2. FFPE小鼠脑组织的分析(A) 海马区突出显示的冠状面H E图像（左）。海马区的放大视图（右）。突出显示3个解剖结构（右上）：视野1锥体层（CA 1 sp）、视野3锥体层（CA 3sp）和齿状回（DG-sg）。来自无监督分析（右下）的3个选定聚类（13、14和15）验证了由分子特征和神经解剖学定义的结构之间的对应关系。(B) 具有（A）中突出显示的簇13、14和15的UMAP嵌入。(C) 点图显示了（A）和（B）中每个海马簇的前5个最显著的标志物基因。(D) (i)基因-基因散点图显示FFPE数据和从新鲜冷冻组织获得的数据集之间的log 10转换基因计数（Pearson相关性评分为0.95，p值为2.23 10- 16）。（ii和iii）手动配准到Allen Brain Atlas的冠状小鼠脑组织切片的HE图像（ii）新鲜冷冻和（iii）FFPE组织。右叶代表艾伦脑图谱定义的11个解剖区域的地图。(iv)热图显示了FFPE和为11个解剖区域中的每个区域计算的新鲜冷冻数据集之间的一致性。(E) 跨解剖区域的斑点组成显示为相对比例。(F) 使用细胞类型映射方法立体镜将来自同皮质的5种神经元细胞类型亚类映射到FFPE冠状切片。每个点通过饼图说明，该饼图显示5种细胞类型亚类的相对组成细胞类型亚类缩写：L2/3 IT CTX 1，端脑内大脑皮质层2/3;L4/5 IT CTX，端脑内大脑皮质层4/5; L5 IT CTX，端脑内大脑皮质层5; L5 PT CTX，大脑皮质层5锥体束; L 6 CT CTX，皮质丘脑的大脑皮质层6。(G) 在UMAP空间中显示的5种细胞类型亚类的比例值的可视化（与F中所有5种细胞类型都富集在大脑皮层（CTX）中的簇结果FFPE空间转录组学数据概括了小鼠脑在各种项目中，使用多基因组学方法结合详细的神经解剖图对小鼠大脑进行了广泛的表征这些努力使小鼠脑成为评估和探索空间转录组学应用于FFPE组织。小鼠脑的解剖结构已经基于来自Allen Brain Atlas18、19的冠状参考中的HE染色组织切片的组织学特征进行了详细注释，其中每100m m收集的132个组织切片沿着前后轴跨越整个小鼠脑。使用这个解剖学参考，我们可以确定收集的组织切片沿前后轴的位置。Cell Genomics1，100065，2021年12月8日5会开放获取技术老鼠的大脑，并绘制出基于组织学的解剖结构。此外，我们推断，从FFPE组织获得的空间转录组学数据与从使用常规方法包埋的组织获得的数据之间的比较，分析FF组织，对于评估数据的质量方面（例如基因恢复和复杂性）将是有价值的。因此，我们下载了从在冠状面中切片的FF小鼠脑组织获得的公开可用的空间转录组学数据集（可从10 x Geno-Doppler20获得）以用作参考。接下来，我们通过匹配组织组织学，在沿着前后轴与FF切片大致相同的距离处从该组织切片，我们使用我们的空间FFPE原型生成空间转录组学数据。使用全脑框架21将FF和FFPE冠状小鼠脑组织切片的HE图像配准到冠状参考图谱（图S4A）以绘制出解剖区域。在每个组织覆盖的点约50 k读段的测序深度下，获得了总共2，533个条形码捕获位置（点），平均约1，200个独特基因，从FFPE组织中每个斑点检测到约2，200个独特分子（表S2;图S4 B）。在数据标准化后，基于表达的聚类鉴定出总共16个簇，其清楚地对应于已建立的解剖结构（图S5簇2、13、14和15形成海马（HIP）区（图S4A和S6），而簇13和15映射到阿蒙角锥体层的区域1和3这些小结构的细粒度映射阐明了FFPE空间转录组学数据如何可以用于以无偏的方式解析仅由几个点覆盖的结构。此外，差异表达（DE）分析显示CA 1 sp区中已知标记基因Fibcd 1和Spink 8（兴奋性神经元，海马CA 1）、CA 3sp区中Cabp 7和Bok（兴奋性神经元，海马CA 3）以及DG-sg22中C1 ql 2（颗粒神经元，DG）的上调（图2C）。FFPE数据的均匀流形近似和投影（UMAP）嵌入（图S5B）表明，斑点转录谱聚类成反映小鼠大脑形成大脑皮层（CTX）、下丘脑（HY）、纤维束、丘脑（TH）、纹状体（STR）、侧脑室（VL）和HIP区域的较大解剖区域的结构。接下来，我们着手探索我们的FFPE空间转录组学数据集定义与解剖区域相关的mRNA标记物的能力。对于16个簇中的每一个，从DE分析中选择一个代表性标记基因（表S4;图S5 C），并将其表达模式与已发表的原位杂交（ISH）18图像进行比较（图S7）。空间转录组学数据中标志物表达值的空间分布与ISH图像一致，因此突出了以无监督方式从FFPE材料中提取分子标志的潜力为了系统地评估我们的FFPE衍生的空间转录组数据的质量，我们将我们的FFPE数据集与公开可用的FF数据集（2，698个点）进行了比较（图S4）。在每个组织覆盖的点的测序深度约为115 k读段时，FF数据集平均覆盖约6，000个独特基因，每个斑点约27，200个独特分子（图S4B）。在两个数据集中，大多数捕获的分子被注释为蛋白质编码，尽管我们在FF数据集中确实观察到较大基因间非编码RNA（lincRNA）、核糖体蛋白质编码基因和线粒体蛋白质编码基因的相对丰度较高（图S4C）。作为批量处理的FFPE和FF数据集之间的Pearson r评分为0.95，p值低于2.23 10- 16（图2Di和S4D），表明两种数据类型在批量水平上具有此外，我们着手测量从两个数据集恢复的表达谱之间的一致性。我们推断，尽管我们可以观察到两种条件之间捕获效率的实质性差异，但解剖学定义区域的基因表达特征在全基因组范围内应显示出高度一致性。为了进行这种比较，我们使用来自HE图像的组织学信息来定义解剖区域。首先将FFPE和FF组织切片的HE图像手动配准到冠状参考图谱，以使用全脑工作流程生成脑解剖图。基于手动配准，然后将点分组成11个预先选择的解剖区域（图2Dii-在11个区域中的每一个区域内，我们通过比较相对于背景的表达水平和检测率来计算每个基因然后将这些富集曲线用作计算两个数据集区域之间的秩偏重叠（rbo）的基础重叠估计值的总结见图2Div，显示从FFPE和FF组织获得的空间转录组学数据之间匹配的解剖区域之间的基因表达高度一致。已经提出了几种计算方法来使用单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据对斑点的混合转录谱进行去卷积。在这里，我们使用概率方法立体镜23来使用从Allen Mouse Brain Atlas倡议获得的scRNA-seq SMART-seq数据集绘制出41种不同的细胞类型亚类。24单细胞作图方法允许我们将我们的FFPE和FF数据集的点转录组解卷积为逐点比例估计，这意味着可以评估每种细胞类型的空间分布（图S8A）。当观察总细胞类型比例时，即，在所有点上求和的细胞类型比例中，我们在两种数据类型中的所有细胞类型中观察到相似的比例估计值（图S8B）。为了比较两种数据类型中细胞类型的分布，我们可视化了映射到HIP区域、等皮质和纤维束的细胞类型子集的估计比例（图S8C）。在HIP区域中，我们发现CA1、CA3和DG细胞类型的高度富集（图S8Ci），证实了我们先前从聚类分析中观察到的结果与其他10个解剖区域相比，5种神经元细胞类型亚类在同皮质中明显富集（图2F、2G和S8Cii），这些细胞类型的空间分布概括了文献中先前描述的分层组织。此外，我们注意到纤维束中寡树突细胞的富集（图S8Ciii），它们在长距离纤维的25对于一些细胞类型，我们6Cell Genomics1，100065，2021会开放获取技术在FF数据集中观察到更强的信号，特别是对于映射到TH的细胞类型（图S8Civ）。增加的信号强度的最可能解释是FF数据中较高的mRNA然而，我们还预期在两个组织切片中观察到细胞类型组成的一些变异性，因为它们是在沿前后轴略微不同的距离处收集的。简而言之，我们发现FFPE和FF数据集之间细胞类型比例估计值的空间分布总体上高度一致，尽管mRNA捕获效率存在显著差异。这些发现支持我们的方案的适用性，以从FFPE组织产生空间分辨的转录组学数据，其具有足够的复杂性以检测细胞类型特异性基因表达特征。我们还创建了一个公共数据浏览器，用于 查 看 当 前 研 究 中 生 成 的 所 有 数 据 （ GitHub ：https://github.com/ludvigla/FFPE_mouse_brain_explorer）。这里，所有41种细胞类型的细胞类型比例估计值可以可视化并在两个数据集之间进行比较。空间转录组学方法已成功应用于许多生物系统，以揭示通常需要从多个个体收集重复组织切片以恢复组织异质性的完整表现的分子过程。因此，为了获得任何组织类型的代表性数据集，该方法的再现性至关重要。我们试图解决我们的FFPE适应的空间转录组学方案在从不同FFPE块收集的复制切片上的再现性。从FFPE小鼠脑组织的冠状切片获得总共7个空间转录组文库，每个斑点平均900至2，077个独特基因，每个斑点平均1，208至4，064个独特分子标识符（UMI）（表S2;图S9 A）。在三个单独的实验中获得文库，并且我们观察到质量指标在每个实验批次内显示出很小的变化，但是在批次之间变化。这种批次特异性效应通常在转录组学数据中观察到，其原因包括样品处理、组织质量、可变测序深度和实验程序的变化。为了对抗这些技术影响，我们应用了harmony，27一种多数据集整合方法，用于在多个实验批次中找到基因表达谱的共同嵌入。使用UMAP将和声嵌入进一步压缩为2维表示，然后进行无监督聚类，生成25个聚类（图S9B）。尽管三个批次的数据质量差异很大，但可以从每个批次中回收到数量相当的25个聚类（图S9C）。整合后的基因表达谱的颜色编码（参见STAR方法）突出了7个组织切片中空间域内基因表达谱的相似性（图S9D）。空间分辨转录组学描绘了多聚甲醛固定的类器官的异质性。干细胞衍生的三维培养系统称为类器官，已经成为以惊人的细节离体重建人体器官的结构和生理学的重要模型系统。这些模型很容易操作和监测，因此为研究人员研究生物学提供了一个有价值的工具。物理过程、药物的毒理学效应和扰动效应。人类类金刚石的一些最突出的应用包括对传染病、遗传疾病、癌症和再生医学的研究，29以及用于药物开发和诊断目的的基于细胞的30最重要的是，与SARS-CoV-2大流行一致，类器官已被用于研究肾脏和肝脏中的进入和疾病进展机制31-作为原理证明，我们使用包埋在最佳切割温度包埋介质（OCT）中的未感染的PFA固定的肺和肾类器官在PFA中固定类器官将使研究人员在储存，运输和嵌入时间方面具有灵活性为了本研究的目的，将6至8个类器官（直径1 mm）包埋在一起以适合单个捕获区域（42.25 mm2），每个类器官覆盖50至150个点（图S10B和S11B）。从含有肺类器官的组织块中收集4个连续的组织切片，从含有肾类器官的组织块中收集3个组织切片。从这些数据集中，从每种组织类型中保留6个类器官对于肺类器官，我们检测到每个斑点的独特基因的平均数量在1，444和2，079之间（图S10A），而对于肾类器官，我们检测到每个斑点的平均独特基因为1，253和2，086（图S11A）。肺类器官的无监督聚类鉴定了跨类器官的大的转录变异（图S10C和S10D）。在6个类器官中的4个中存在的主要簇0中，我们发现代谢基因（GAPDH、SCD）以及间充质标志物波形蛋白（VIM）的表达升高，表明存在干细胞/祖细胞。此外，我们还观察到了0簇中ENO2的上调，这是肺内分泌细胞的一种已知标志物。仅在类器官4中检测到的簇1显示出一组独特的上调基因，包括主要组织相容性复合体（MHC）I类基因HLA-B和HLA-C以及LIN 28 A，LIN 28 A是未分化的人胚胎干细胞的标志物。图5举例说明了一个具有独特表达谱的区域，该区域只能在单个类器官（类器官1）中检测到，与粘膜炎相关的基因表达升高，包括表面活性蛋白B（SFTPB）、前梯度蛋白2同源物（AGR 2）和前胃泌素（PGC）。在肾类器官中，我们观察到整体较低的组织异质性，可能反映了模型的复杂性较低（图S11C和S11 D）。簇2与类器官边缘共定 位 ， 表 达 球 足 细 胞 的 众 所 周 知 的 标 记 物 ， 如 足 蛋 白（NPHS2）和足细胞萼蛋白样蛋白1（PODXL）。36总之，这些结果表明，空间分辨转录组学数据提供了足够的分辨率来揭示PFA类器官的异质性。空间转录组学鉴定了相关的分子特征与组织病理特征在HGSC为了评估我们的方法对临床FFPE样品的适用性，我们从FFPE卵巢癌肉瘤（具有肉瘤组分的高级别浆液性癌[HGSC]）产生了空间条形码化的基因表达文库。样品具有Cell Genomics1，100065，2021年12月8日7会开放获取技术图3.FFPE卵巢癌肉瘤组织的探讨性分析(A) 基于形态学特征手动注释的代表性区域的组织学图像（HE）。蓝色虚线界定了与癌相关黄色虚线标记分布在组织中的脂肪小叶肉瘤区（红点）主要位于脂肪小叶和癌之间的间隙，显示不同程度的恶性。免疫浸润（绿色虚线区域）在某些区域也可见(B) 热图显示了一组选定因素的前10个最有贡献的基因（每列中的值已重新调整(C) 一组选定因子的空间活动图（与B中相同），显示形态特征和基于表达的模式之间的联系因子活动值已重新调整为0到1的范围具有较低值的点更透明，而具有较高值的点不太透明。在实验前储存1年零8个月。分别从网膜采集的一个活检组织的两个组织块制备2个相邻切片。HE染色切片的双视野图像鉴定了主要癌细胞和肉瘤细胞的异质混合物，其散布有脂肪小叶（图3A），以及免疫细胞浸润、脉管系统和存在少量分散的砂粒瘤体。肿瘤的致癌成分是高级别浆液性癌，呈现高细胞密度巢的形态学，由于乳头融合而具有许多不规则的裂缝样空间（图3A）。肉瘤成分的特征在于具有增加的核小体的纤维梭形细胞（图3A）。平均而言，我们每个斑点检测到1，090至1，361个基因和1，810至2，372个UMI（图S12A;表S3）。我们发现相邻切片之间（R = 0.98，p = 2.23 10- 16;图S12 B）以及从不同研究中心采集的切片之间（R = 0.98，p = 2.23 10- 16;图S12 C）具有很强的相关性，表明两个研究中心的组织组成在整体水平上具有高度相似性为了使用细胞类型映射方法对空间转录组学数据进行稳健的细胞类型去卷积，代表性scRNA-seq数据集应覆盖大多数细胞类型。组织切片中存在的类型。对于具有高患者内和患者间异质性的组织类型，理想情况下，scRNA-seq数据应与空间转录组学数据配对，即，都是从同一个组织里提取的鉴于HGSC肿瘤代表具有高患者间变异性的高度异质性组织，我们推断从其他患者收集的公开可用的scRNA-seq数据不满足推断正确细胞类型比例的要求。此外，从FFPE组织内部生成scRNA-seq数据仍然是一个挑战，因为福尔马林固定的细胞难以分离和处理。因此，在不存在代表性scRNA-seq数据的情况下，我们决定使用非负矩阵因子分解（NNMF）37作为探索性方法，以无偏倚的方式对我们的HGSC数据进行去卷积。简而言之，该方法将基因表达建模为预定数量的因子的圆锥线性组合，其中每个因子是反映与相关基因组相关的数据中的变异性的潜在变量。与用细胞类型映射方法推断的细胞类型比例相反，因子可以代表生物变异性的任何来源，例如稳态过程、细胞类型和共定位细胞类型的集合。因子可以通过以下方式与特定标记基因的表达直接相关：8Cell Genomics1，100065，2021会开放获取技术探索基因加载（或基因权重）向量，其确定每个基因对因子活性的贡献。在该分析中，我们将来自4个HGSC组织切片的空间转录组学基因表达数据分解为总共15个因子，将其作为空间因子活性图谱进行探索（图S13;表S5）。15个因子的选择过程并不完全，但它们被选择来概括在HE图像中观察到的主要形态模式。NNMF因子活性在组织学图像上的叠加显示因子确实是空间分布的，并且具有妇科癌症专业知识的病理学家可以容易地建立与可观察到的组织学特征的关联（图3A和3C）。空间活动图在连续切片中也是一致的，表明技术变异性较低（图S12和S13）。因子1、7和12通过高因子活性与由HE图像的病理学评估定义的组织学特征相关联而与富含肉瘤细胞的区域相关联（图3A和3C）。对所有3个因子的最主要贡献基因的功能富集分析鉴定了上皮-间充质转化（EMT）术语的强烈富集（图S14;表S6），38部分由COL 1A 1、COL 1A 2、COL 3A 1、VIM和MMP 2的上调定义（表S5 ;表S6）。图S13）。类似地，对于因子2、6和11，我们发现与癌和KRT 7富集区域的相关性是3个因子的主要贡献者，与先前肿瘤KRT 7+状态的病理学评估一致（表S5）。有趣的是，因子4在空间上与混合恶性细胞亚组重叠，包括脂肪组织附近的癌和肉瘤在最主要的驱动基因中，我们发现了肌成纤维细胞相关基因（例如，ACTC 1、MYL 1、TPM 2）（图3B、S13和S14;表S5）。癌症相关的肌成纤维细胞先前已在文献中描述于多种癌症类型39-39肌成纤维细胞-上皮细胞相互作用已经在子宫内膜癌40中描述，其中肌成纤维细胞已经被发现在肿瘤细胞附近表达许多生长因子和细胞周期蛋白，从而除了自身增殖之外还促进肿瘤生长。因子3在空间上与脂肪组织区域对齐，并且还富集脂肪相关基因的表达（图3B、3C和S13;表S5），而因子5更特异性地定位于类似于间皮的脂肪小叶的边缘（图S13）。补体成分成为该因子的主要贡献基因（C3、C1S、C1R、CFB）。基于使用来自MsigDB的癌症标志基因集集合的功能富集分析，因子5显示术语补体和凝血的富集（图S14）。因子10与小动脉和内皮平滑肌共定位，由VWF、SERPINF1和A2M的表达驱动。该因子也出现在脂肪组织中，尽管信号略微减弱。其余因子（8、9和13）富集了免疫相关术语（表S5），尽管存在一些差异，之间的因素。因子8由MHC I类和II类基因驱动，表明存在抗原呈递细胞。在因子13中，我们发现免疫球蛋白（IGKC、IGHA 1）和MZB 1是最主要的贡献基因（图S13;表S5），表明该因子代表浆细胞。根据该因子的空间分布判断，浆细胞主要位于肉瘤区域外，集中在基质和脂肪组织中的较小聚集体中（图3C）。免疫组件的一COVID-19感染肺鉴于最近的COVID-19大流行，我们还对来自一名30岁男性SARS-CoV-2PCR阳性患者的染色FFPE肺活检进行了空间全基因组mRNA分析，该患者在肺采样时发热数天。收集2个相邻的组织切片（图4A），覆盖总共1，504个点，分别具有平均1，860个独特基因和3，487个UMI。仅1个UMI计数可检测到SARS-CoV-2来源。活检组织包括：（1）一小块支气管组织（覆盖634个点;图4和S15A），具有支气管相关淋巴组织（BALT），三级淋巴结构（TLS），以密集堆积的滤泡形式存在;（2）一个小肺泡区域，具有覆盖208个点的细支气管（图4和S15B），显示支气管区域周围广泛的淋巴细胞浸润（BALT的BALT不是健康成人肺的成分，因为它仅作为对感染或炎症的反应出现，而它是在具有正常健康状况的儿童和青少年的肺中发现的成分43，44考虑到他的年龄（30岁）和他的临床病史，在我们的COVID-19患者中观察到的BALT被假设为感染后的指征。四十三，四十五鉴于SARS-CoV-2转录本的检测有限，我们询问这一观察结果是否可以通过组织中的低病毒载量或我们的方法检测病毒转录本的能力有限来解释为了解决这个问题，我们进行了靶向SARS-CoV-1刺突蛋白的免疫荧光（IF）测定，该蛋白已显示与SARS-CoV-2刺突蛋白交叉反应（图S16）。46我们从DAPI染色中分割细胞核，并估计组织中的细胞总数约为4，000个（参见STAR方法）。基于SARS-CoV-2刺突蛋白的免疫染色，我们估计只有89个阳性细胞（图S16;见STAR方法），表明病毒感染水平较低我们认为这是一个合理的结果，因为样本来自一名表现出COVID-19中度症状的患者，并且肺部的病毒传播通常遵循多灶性异质模式，其中肺部区域可能表现出几乎正常且不存在病毒颗粒47为了以无偏的方式进一步探索SARS-CoV-2感染的肺组织数据，我们使用前面描述的NNMF方法将空间转录组学数据解卷积为15个因子。基于与每个因子相关的最重要的贡献基因并通过因子活性图与HE图像的叠加来注释每个因子（图S17）。此外，我们使用公开可用的人肺48的scRNA-seq数据集来探索与25种不同细胞类型相关的差异表达基因的富集（图S18）。评估细胞类型标记基因的富集Cell Genomics1，100065，2021年12月8日9会开放获取技术图4. COVID-19感染肺组织(A) （中）从感染COVID-19的FFPE肺组织收集2个组织切片，以获得空间转录组学数据。组织切片的2个区域（支气管组织和含细支气管的肺泡组织）证实了（右和左）基于组织的组织学特征注释的选定区域的放大视图(B) 在HE图像上可视化的与BALT相关的4个所选因子的空间因子活性图（顶部两行）。每个因子的前20个驱动基因按基因权重降序排列（底行）。通过使用先前描述的方法49（参见STAR方法）计算细胞类型特异性标志物基因的曲线下面积（AUC）得分，此后，我们计算了细胞类型富集和因子活性评分之间的Pearson相关性，以发现 细胞类型标 记基因和因子之间的关 联（图 S18）。尽管scRNA-seq数据集代表了来自健康组织的细胞，而不是感染SARS-CoV-2的组织，但这些关联中的许多关联与因子的特征（关于其主要贡献基因和空间位置）一致。因子9与TLS共定位，在最主要的驱动基因中具有多种趋化因子，最值得注意的是CCL 19、CCL 21和CXCL 13（图4C;表S7），并且还显示出与B细胞和T细胞特征的高度相关性（图S18）。滤泡树突状细胞（FDC）是CXCL 13和CCL 21的主要生产者，因为它们吸引和组织淋巴组织内的免疫细胞，其中CXCL 13是正确形成密集的B细胞滤泡所必需的。51作为FDC存在的额外支持，我们发现CR2（CD21）是最常用的驱动基因（IHC52最常用的FDC表面标志物之一）以及FDCSP标志物基因（FDC分泌肽前体）。我们还检测到其他淋巴细胞标记物包括T细胞受体成分TRAC、TRBC 1/2和B细胞标志物MS 4A 1（CD 20）。BALT标记中存在的另一个感兴趣的基因是乳铁蛋白（LTF），其是已知通过影响自然杀伤（NK）细胞和巨噬细胞来抑制病毒复制的先天性免疫系统组分，过去已发现其与SARS（SARS-CoV-1）相关上调。54卵泡边缘周围的斑点主要被分配给因子3（图4B），主要由免疫球蛋白（Ig）基因IgA（JCHAIN、IGHA1和IGHA2）、IgG （ IGHG 3 、 IGHG 1 ） 和 IgM（IGHM）的表达驱动（图4B）。图4B;表S7）。这些基因表明正在进行的免疫反应，这进一步得到了与浆细胞富集评分相关性的支持（图S18）。与这一结果相一致的是，先前对BALT的研究发现浆细胞通常位于卵泡的边缘四十四、五十五、五十六因子7显示免疫浸润区域的强烈富集，包括TLS的边界（图4B）。它还表达CCL 21，一种在淋巴组织中富集的趋化因子，这可能表明淋巴管的存在，因为这种趋化因子是由衬在淋巴管上的淋巴内皮细胞（LEC）产生的。[57]这一结果与以前的报道一致，即淋巴管通常位于卵泡周围。58同样，对于因子10，我们发现与TLS外的免疫浸润区域相关（图4B）。由巨噬细胞合成和分泌的补体亚组分C1q的3个结 构 单 元 59 、 60 出 现 在 该 因 子 的 主 要 贡 献 基 因 （ C1QA 、C1QB 、 C1QC ） 中 ， 以 及 其 他 特 异 性 巨 噬 细 胞 基 因（CD163）和较不特异性的基因（组织蛋白酶：CTSD、CTSL、CTSB）。此外，我们发现因子10与巨噬细胞富集评分之间存在高度相关性（图S18），表明该因子总体上反映了组织中巨噬细胞的空间分布。10Cell Genomics1，100065，2021会开放获取技术档案样本调查已经表明，RNA质量有随着FFPE批量老化而下降的趋势。61，62我们期望在将空间转录组学方法应用于FFPE时观察到类似的效果，并询问我们自己是否将存档组织块储存较长时间（例如，几十年）可以产生与储存几年的组织块相当的cDNA产量我们决定使用我们基于TSO的QC检测方法对分别储存37、
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