细胞周期调节中的DWNN蛋白与NEK6相互作用的研究

医学信息学解锁23（2021）100522RBBP 6相互作用组：RBBP 6同种型3/DWNN和Nek 6相互作用对细胞周期调节至关重要，并可能在致癌作用中发挥作用Zukile Mbitaa，**，Rodney Hullb，Mokoena b，Chin-Hung Lai c，Zodwa Dlaminib， *a林波波大学生物化学、微生物学和生物化学系，Sovenga，0727，南非bSAMRC/UP艾滋病毒相关癌症精确预防和新药靶点校外股，泛非癌症研究所，比勒陀利亚大学，0028，Hatfield，南非c中山医科大学医学应用化学系，台中，40241，台湾A R T I C L EI N FO关键词：RBBP6DWNNNEK6蛋白质对接细胞周期调控A B S T R A C TRBBP6是一种多结构域蛋白，具有四种剪接变体，翻译成四种功能同种型。已报道RBBP 6同种型1与TP 53和pRb以及调节对肿瘤发生的转录应答的蛋白质如HDM2、ZBTB 38、YBX 1和NEK 6相互作用。异构体2和4的实验验证尚未进行。第三种亚型，仅由DWNN结构域和短的无序c末端组成，已显示在几种人类癌症中下调，并被证明是G2/M细胞周期停滞的调节剂。许多研究支持DWNN在细胞周期调控中的作用，然而，其在这些过程中的机制仍然不清楚。DWNN的翻译后修饰可能对其功能至关重要，本研究旨在了解DWNN如何调节细胞周期。我们的研究确定了12个细胞周期相关的蛋白与DWNN使用各种生物信息学工具相互作用。我们还鉴定了10种与DWNN相互作用的泛素连接酶。据报道，最相关的相互作用伙伴，细胞周期调节因子Nek6，在细胞周期期间与DWNN相互作用。因此，通过同源建模和对接来询问Nek6和DWNN之间的相互作用是至关重要的。DWNN突变体对NEK6的亲和力降低，其中至少一种突变体具有影响至少一个磷酸化位点的变化。NEK6可能通过磷酸化DWNN促进细胞增殖。这项工作表明，DWNN共调节RNA剪接，泛素化和细胞周期控制。因此，DWNN可以通过细胞周期调节用于新型抗癌疗法1. 介绍视网膜母细胞瘤结合蛋白6（RBBP6）基因在广泛的真核生物中是保守的[1]。它的蛋白质同种型涉及各种生物学过程，包括细胞周期调节[2]和mRNA加工[3，4]。为了促进这些细胞功能，RBBP 6蛋白含有许多功能结构域，其中包括N-末端无名结构域（DWNN）、锌指和E3连接酶活性RING指结构域。通过RING指结构域，RBBP6已被证明促进MDM2介导的p53的泛素化和蛋白酶体降解[5]和促增殖转录因子，BOX结合蛋白1（YB-1）[6]。此外，由于其E3连接酶活性，RBBP6泛素化转录阻遏物、锌指和BTB结构域，含有38（ZBTB38），其控制复制因子微型染色体维持10（MCM10）的水平。因此，RBBP6的敲低导致复制叉运动减少[7]。除了经典的结构域构型，哺乳动物RBBP6还包括视网膜母细胞瘤（Rb）结合结构域、p53结合结构域、富含脯氨酸的区域和富含丝氨酸的区域。事实上，RBBP 6首先在小鼠中被鉴定为Rb- [8，9]和p53结合蛋白[10]，由此衍生出诸如p53相关细胞蛋白睾丸衍生物（PACT）和增殖潜力相关蛋白（P2P-R或PP-RP）的名称[11]。RBBP6已被证明对细胞活力至关重要，因为它的缺乏导致小鼠[5]、苍蝇[12]和蠕虫[13]的早期胚胎死亡。在小鼠中敲低RBBP 6的截短衍生物显示出显著降低p53-Hdm 2相互作用，减少p53多聚泛素化和降解，从而增强p53-Hdm 2相互作用。* 通讯作者。** 通讯作者。电子邮件地址：Zukile.Mbita@ul.ac.za（Z.Mbita），Zodwa.Dlamini@up.ac.za（Z.德拉米尼）。https://doi.org/10.1016/j.imu.2021.100522接收日期：2020年8月27日;接收日期：2021年1月13日;接受日期：2021年2021年1月20日在线提供2352-9148/©2021的 作者。发表通过 Elsevier 公司这是一个开放接入文章下的CCBY-NC-ND许可证（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）中找到。可在ScienceDirect上获得目录列表医学信息学期刊主页：http://www.elsevier.com/locate/imuZ. Mbita等人医学信息学解锁23（2021）1005222积累[5]。p53的积累导致细胞凋亡和细胞生长迟缓。RBBP6在小鼠中的过表达导致细胞凋亡[14，15]，同样，通过RNA干扰技术在小鼠3T3细胞中沉默RBBP6变体1导致对喜树碱诱导的细胞凋亡的抗性[16]。在人类中，RBBP6基因的单拷贝存在于染色体16p12.2上，由于选择性剪接和多聚腺苷酸化而编码四种蛋白质亚型（图1）。人RBBP6是癌症免疫治疗的有前景的靶标，其上调与宫颈癌[17]、胃癌[18]、结肠癌[19]和肺癌[20]的进展密切相关。事实上，RBBP6水平的提高与临床进展不良相关，并与食管癌的低存活率有关[21]。此外，对RBBP 6衍生肽特异性的细胞毒性T细胞能够裂解培养的食管癌细胞并使小鼠异种移植模型中的食管肿瘤消退[1]。目前，对DWNN的作用知之甚少，严格地发现于RBBP 6蛋白的N-末端，并且通过使用选择性多聚腺苷酸化位点被剪接成一个独立的模块，称为RBBP 6同种型3（图1）[22-24 ]。尽管RBBP 6同种型3由DWNN结构域（1-76）和非结构化C-末端区域组成，但只有采用非结构化C-末端区域的DWNN结构域才是最佳的。已经通过核磁共振（NMR）解析了泛素样折叠[1]。DWNN结构域已显示介导与切割刺激因子（CstF-64）的相互作用，其中其他RBBP 6同种型和RBBP 6同种型3竞争结合[3]。同种型3的过表达抑制了新合成mRNA的切割，有趣的可能性的调制3两种RBBP6亚型的水平。此外，RBBP 6亚型3似乎参与细胞周期调节和喜树碱（CPT）诱导的凋亡。此外，与正常样本相比，在结直肠癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌和前列腺癌中观察到更高的亚型3表达水平。这种表达也定位于细胞凋亡水平增加的区域[24]。已知RBBP 6同种型3的表达在某些癌症如食管癌、结肠癌和子宫癌中较高[24]。虽然同种型1的表达在大多数癌症中可以被描述为低至中等[25]（蛋白质图谱。org/ENSG 00000122257-RBBP 6/病理学）。通过使用针对DWNN开发的抗体确定了这些亚型表达的差异，确定了亚型1的表达水平远低于亚型3。这是可能的，因为亚型3显示为10 kDa条带，亚型1显示为200 kDa条带。除此之外，使用特异于DWNN的抗体的检测强度已经与使用特异于RBBP 6的其它区域的抗体的相同样品中的强度进行了比较，所述其它区域未在同种型3中发现，但存在于同种型1、2和4中[26]。重要的是，同种型3缺乏核定位信号（图1）。然而，虽然亚型3主要存在于来自未暴露于应激的细胞的细胞质提取物中。同种型3的核表达在细胞暴露于热或DNA损伤形式的应激条件后增加[26]。应激后，RBBP6同种型3定位于核斑点，其还含有剪接因子SC 35（Spector [27]，并且涉及DNA损伤修复和mRNA加工（[28]）。综上所述，RBBP 6的两种同种型（同种型1和3）在癌症进展过程中表达的差异，以及它们在mRNA加工过程中对结合Cst 64的竞争，表明这两种同种型不起互补作用。我们怀疑RBBP 6亚型3在癌细胞中的低表达可能有助于逃避细胞周期控制和凋亡。事实上，许多研究表明RBBP6在细胞周期的调节中起作用，尽管其机制尚不清楚。本研究的重点是鉴定可能与RBBP6亚型3相互作用的蛋白质，并研究其与Nek6的相互作用。Nek 6是Nima（never in mitosis，基因A）相关激酶（Neks）家族丝氨酸/丝氨酸蛋白酶（丝氨酸/丝氨酸蛋白酶）苏氨酸激酶。这些序列具有40构巢曲霉有丝分裂调节因子，NIMA，在其催化域。Neks在细胞周期调控中起重要作用，最近被描述为在诸如癌症的病理学中起重要作用。人Nek 6、7和9参与有丝分裂纺锤体形成的控制[29]。Fig. 1. RBBP 6同种型的示意图。该图描绘了所有四种RBBP6同种型的结构域结构。异构体2和4由选择性剪接产生。同种型3是由于在外显子3后使用了替代的多聚腺苷酸化位点而产生的改编自Refs。[22Z. Mbita等人医学信息学解锁23（2021）1005223--2. 材料和方法用于研究RBBP6同种型3（NP_116，015）与其他蛋白质的相互作用的计算框架在图2中给出。简而言之，RBBP 6同种型3相互作用网络构建和注释、同源性建模和蛋白质-蛋白质对接使用各种生物信息学工具进行 ， 即 KEGG 、 PFAM 、 CDD 、 Net-Phos 、 KinasePhos 、 Modeler 、Haddock Pro和Haddock。将与RBBP 6同种型3相互作用的蛋白质定位在KEGG上并使用PFAM分类。然后使用CDD-BLAST对其进行比对。使用KinasePhos和NetPhosK进行激酶预测。使用Modeler构建Nek模型，最后使用Haddock Pro和Haddock进行蛋白质-蛋白质对接。2.1. 蛋白质相互作用网络为了获得RBBP 6同种型3蛋白质-蛋白质相互作用网络的正确观点，通过组合从以下数据库获得的命中，构建了基于文献的对实验检测的伴侣蛋白质的搜索：BioGrid [30，31]，DIP [32]，HPRD [33]，InnateDB[34]和IntAct [35]。这些开源PPI数据库填充了所有模式生物的手动管理的蛋白质-蛋白质相互作用数据。此外，还搜索了StringDB库，其中包含从直接（物理）和间接（功能）关联获得的预测蛋白质相互作用[36，37]。图二. 用于鉴定RBBP6的伴侣蛋白并表征其与Nek6的相互作用的与 RBBP6 相 互 作 用 的 蛋 白 质 。 使 用 RBBP6 同 种 型 3 （ 登 录 号 ：NP_116015.2）检索这些数据库未导致相互作用。因此，将全长RBBP6同种型1（登录号：NP_008841.2）用作查询。从这些多个数据库返回的重叠蛋白质用于构建相互作用蛋白质的网络。然后通过去除预测通过其p53、RB1、RING指或锌指结构域与RBBP 6同种型1相互作用的那些蛋白质来精制该蛋白质网络。除此之外，还去除了实验上确定与RBBP 6同种型1相互作用的蛋白质。其余蛋白质序列和数据从Uniprot获得[38]。然后通过将这些蛋白质用作KEGG途径数据库中的查询来功能富集这些蛋白质，所述KEGG途径数据库将每种蛋白质映射到典型途径和家族[39]。选择参与细胞周期和泛素化的蛋白质进行进一步分析。这导致了一组参与细胞周期和泛素化的蛋白质，它们可能只与DWNN结构域相互作用，因此这些蛋白质而不是排除的蛋白质可以与RBBP 6亚型3相互作用。PFAM用于使用蛋白质家族的大而全面的集合来搜索查询并将其分类到蛋白质家族中，每个蛋白质家族由多个序列比对表示，隐马尔可夫模型（HALGOT）配置文件[40]。CDD-BLAST资源包含古结构域和全长蛋白质的注释良好的多序列比对模型。它依赖于RPS-BLAST，一种修改版PSI-BLAST，以快速扫描一组具有蛋白质查询的预定位置特异性评分矩阵（PSSM）[41，42]。2.2. 突变和同源性建模DWNN的磷酸化位点使用Kin-asephos 2.0（一种激酶特异性磷酸化位点预测工具，适用于基于序列的氨基酸偶联模式分析和溶剂可及性[43]）和NetPhosK 1.0服务器（生成激酶特异性真核蛋白磷酸化位点的NN预测）进行预测[44]。对Nek6（Uniprot登录号：Q9HC98）以及被鉴定为与RBBP 6同种型3密切相互作用的不具有晶体或NMR结构的其他蛋白质进行同源性建模。即MZT2（Uniprot登录号Q6NZ67），GINS 2（Uniprot登录号Q9brt9），RNF115（Uniprot登录号Q9Y4L5），MAX（Uniprot登录号P61244），UBE2L2（Uniprot登录号Q7Z7E8），RLIM（Uniprot登录号Q9NVW2），PRKAA（Uniprot登录号Q13131）、CUL5（Uniprot 登 录 号 Q93034 ） 、 TRIP12 （ Uniprot 登 录 号 Q14669 ） 、UBE2L3 （ Uniprot 登 录 号 P68036 ） 和 UBE2Q2 （ Uniprot 登 录 号Q8WVN8）。同源性建模也进行了其他细胞周期regu，结合蛋白，鉴定为与RBBP 6同种型3相互作用。这些包括PLK1（Uniprot登录号014，777）、PRKAA1（Uniprot登录号Q12121）、SMAD3（Uniprot登录号P48022）、MAX（Uniprot登录号P61242）和MZT 2（Uniprot登录号Q6ZN7）。使用HHPred网络服务器识别用于建模Nek6（Nek7 PDB ID：2WQM）的模板[45]。然后使用具有预测局部结构和3D约束的PROfile多重比对（PROMALS3D）比对工具[46]生成准确的靶点与模板比对。使用MODELER 9v18构建模型，并缓慢细化[47]。 还进行了环细化，以预测具有最少立体化学违规的Nek6的最合理的3D模型[48]。为每种蛋白质生成了数百个模型，并根据能量评分进行排名。通过DOPE Z评分计算选择最佳的三个模型。使用RAMPAGE [49，50]、Verify3D [51]和ProSA [52]进行最终评价。 Nek6模型的Z评分为0.76，QMEAN评分为2.66，而RBBP 6同种型3模型具有Z评分为0.63，QMEAN评分为2.68。因此，这些模型显示出与实验模型结构的良好拟合2.3. 蛋白质对接蛋白质对接 研究是 携带 出来 通过对接Z. Mbita等人医学信息学解锁23（2021）1005224RBBP 6 同 种 型 3 同 源 性 模 型 与 针 对 NEK 6 、 MZT 2 、 GINS 2 、RNF115、MAX、UBE 2L2、RLIM、PRKAA、CUL5获得的3D模型，TRIP12、UBE2L3和UBE2Q2，使用了TRIPPro V2 [53，54]和HADDOCK[55，56]。下载RBBP 6同种型3与之相互作用的其他蛋白质的蛋白质数据库文件，因此不需要3D建模。这些包括TUBG 1（Uniprot登录号P23258）、NDC 80（Uniprot登录号O14777）、UBE 2G2（Uniprot登录号P60604）、CHMP4B（Uniprot登录号Q9H444）、UBE 2Q1（Uniprot登 录 号 Q7Z7E8 ） 、 RNF126 （ Uniprot 登 录 号 Q9BV68 ） 、 PCNA（Uniprot登录号Q15004）和HECW2（ Uniprot登录号Q9P2P）。为了去除假阳性，我们选择了来自HADDOCK Pro服务器的前20个姿势（包括10个姿势和10个有利疏水相互作用的姿势的集群）和来自HADDOCK的前10个姿势，用于使用Dock Score服务器进行评估[57]。蛋白质-蛋白质界面相互作用的结构分析、接触细节和统计数据在PDB sum webserver上进行[58，59]。此外，使用蛋白质相互作用计算器（PIC）网络服务器[60]确定可能参与疏水相互作用、氢键和静电相互作用的残基。使用Swiss-PDB查看器显示了其中鉴定了相互作用残基的MSPPro模型，显示了参与相互作用的氨基酸侧链。2.4. DWNN突变体和磷酸化此外，对两种RBBP 6同种型3突变体S25A和T49A进行同源性建模。这些突变体由DWNN的野生型NMR结构（PDB ID：2C7H）建模。SWISS模型程序用于模拟由两个DWNN突变体S25A和T49A中的氨基酸变化引起的DWNN三维结构的变化。通过Netphos生物信息学程序预测RBBP 6同种型3中可能被磷酸化的残基[61]。3. 结果3.1. RBBP6相互作用网络和通过途径分析富集基于对RBBP6相互作用的相对缺乏了解，利用6个数据库进行了构建其蛋白质网络图谱的努力。这导致在所有数据库中总共鉴定出133种独特的DIP未获得匹配结果，而来自其他三种基于文献的PPIInnateDB [62]（28个相互作用者）、IntACT [63]（38个相互作用者）、Bio-Grid（122个交互器），HPRD [64]（11个交互器）和StringDb（10个交互器）。在所有这些相互作用物中，133种独特的蛋白质在所有数据库中重叠（表1）。 这个由133名人类和老鼠与RBBP 6的相互作用物[5，6，10，65仅与DWNN结构域相互作用的蛋白质这将使我们表1预测通过DWNN结构域与RBBP 6同种型3相互作用的蛋白质的鉴定阶段。数据库搜索生物格栅先天db完整STRINGDBHPRD烫122283810110所有数据库中的独特蛋白质133蛋白质与DWNN结构域83蛋白使用KEGG分析细胞周期蛋白24蛋白泛素连接酶10蛋白凋亡2蛋白代谢6蛋白mRNA加工24蛋白MAPK 7蛋白质类FOXO信号10蛋白为了更好地表征RBBP6同种型3通过其蛋白质相互作用的作用，去除了通过与RBBP6相互作用的配偶体蛋白（例如p53、RB1、RING指）发生的所有相互作用以及实验验证的相互作用。其余蛋白质序列和数据从Uniprot获得[38]。KEGG分析表明，RBBP 6/DWNN相互作用蛋白的6条主要途径是代谢途径、mRNA监视途径、泛素介导的蛋白水解途径、细胞周期途径、MAPK途径和FOXO途径。这些发现与实验研究一致，实验研究表明RBBP 6的所有同种型（通过DWNN结构域）参与mRNA监视、泛素介导的蛋白水解和MAPK信号传导途径。重要的是要注意，由于RBBP 6的所有同种型都具有DWNN结构域，因此Nek 6和DWNN结构域之间的相互作用不是同种型3所独有的。这对于所有已鉴定的相互作用蛋白质都是如此。然而，异构体3与这些蛋白质的相互作用可以通过竞争结合位点来调节其他异构体与这些蛋白质的相互作用此外，如果这些蛋白质是DWNNY化的靶标，那么同种型3不仅可以抑制其它RBBP6同种型与鉴定的蛋白质的结合，而且还可以导致它们的降解。。对这些蛋白质进行了进一步的分析。3.2. mRNA加工mRNA前体的多聚腺苷酸化是真核生物mRNA合成的关键步骤， 蛋白 复杂. RBBP6 同种型 1 和 RBBP6 同种型3（通过DWNN结构域）被认为是富含AU的UTR（如c-Fos和c-Jun）的3′mRNA加工的调节因子[1，3]。所有RBBP6亚型都被怀疑与肿瘤的核心因子相关。mRNA加工; CPSF 1、CPSF 2、CPSF 4、CPSF 6、CSTF 2和CSTF 3 [3]。这种相互作用是由泛素样结构域DWNN介导的，DWNN已显示出竞争RBBP6与CstF64（CSTF2）的结合[3]。也有人提出RBBP 6与Pinin相互作用[81]，Pinin结合E-钙粘蛋白的E-boX1核心序列，从而促进基因转录。stringDB鉴定了两种含有Trp-Asp（WD）重复序列的蛋白质（WDR 33和WDR 82）和切割和多聚腺苷酸化因子（CPF）复合物的另一种组分，RNA聚合酶II亚基A C-末端结构域磷酸酶SSU 72，作为RBBP 6所有亚型的相互作用伴侣，/DWNN域。分子结构和动力学的3′然而，由于对RBBP 6的加工复合物仍然知之甚少，因此我们建议这些与RBBP 6亚型3的相互作用的实验验证可能是实现这种理解的重要一步。RBBP6可能与Pinin、WDR 82、WDR 33和已知的CPF复合物因子一起构成功能性mRNA加工复合物。3.3. 泛素介导的蛋白水解与细胞周期调控StringDB映射了RBBP6的11种更独特的蛋白质配偶体（图3A）。这些蛋白质都参与泛素化，是E2或E3泛素连接酶。细胞内蛋白质水平的适当控制对生物体的正常功能至关重要。蛋白质降解的适当调节对于生物体内分子途径的正确功能至关重要。事实上，泛素化调节细胞凋亡、抗原加工、DNA修复、蛋白质质量控制、信号转导和应激反应[82，83]。已经确定超过600个人类基因含有基于RING的E3连接酶结构域，其从E2泛素连接酶转移泛素 一个目标蛋白。事实上，RBBP 6同种型而不是同种型3含有RING指，并且已经提出作为E3连接酶发挥作用，并且已经发现通过与泛素连接酶FBXO 7的称为SKP 1-cullin-F-boX（SCF）的泛素蛋白连接酶的四个亚基之一结合而参与蛋白质降解[67]。已经表明RBBP 6的RING指结构域介导与泛素缀合酶UBE 2I的相互作用，所述泛素缀合酶UBE 2I也与Z. Mbita等人医学信息学解锁23（2021）1005225图三.与RBBP 6亚型3/DWNN相互作用的细胞周期和泛素连接酶相关蛋白。该图显示了预测与RBBP 6-同种型3相互作用的（A）10种泛素连接酶和（B）11种细胞周期调节剂的基本结构第53页。虽然大多数研究都集中在RBBP 6亚型1在泛素化中的作用，但DWNN已被证明与泛素相似，因为它与泛素可重叠。泛素标记蛋白质以供蛋白酶体降解[1]。DWNN和热休克蛋白HSPA14之间的相互作用支持了DWNN参与伴侣介导的未折叠蛋白泛素化的假设[80]。DWNN与HECW2、PSME 1、UFL 1和UFM 1直接相互作用的可能性仍有待实验验证。RBBP 6通过DWNN结构域形成同种型，可能通过泛素化和可能的DWNN基团转移到蛋白质来共调节p53活性，这一过程很容易被称为在重要的细胞过程中起作用，如细胞周期控制，因为它已被证明与细胞周期相关蛋白MAD2L2 [84]和纺锤体调节蛋白TPT 1 [85]相互作用。蛋白质-蛋白质相互作用网络预测发现了12种可能与DWNN相关的细胞周期相关蛋白质（图11）。 3 B）。3.4. Nek6的同源模建使用人Nek7的3D结构构建人Nek6的3D结构模型，所述人Nek7的3D结构使用晶体学实验确定。该结构从PDB数据库（PDB条目2WQM）获得，并用作模板[86]。Nek7能够起到模板的作用，因为它与Nek6共享约77%的序列同一性（图4A），并且在催化结构域内共享约86%的序列同一性。基于序列比对，构建了Nek6的截短模型（从残基21开始）。环细化后，Nek6的初级3D模型由同源性建模产生，如图4B和C所示。基于模型质量评估和立体化学质量分析，我们的模型是从Merielles等人（2011）和Srinivasan等人（2014）[29，87]改进而来的。Nek6模型的Ramachandran图与Nek7模型的Ramachandran图比较良好，显示88.1%最有利区域，11.6%额外允许区域和仅0.3%不允许区域（Ser 206），与模板相比，这些值分别为90.8%，8.8%，0.4%和0.0%（图S1）。值得注意的是，Nek 7的晶体结构具有Z. Mbita等人医学信息学解锁23（2021）1005226-----见图4。Nek6的同源模型。（A）使用Nek 7作为模板的同源性建模（A）Nek 7和Nek 6序列的比对显示Nek 7与Nek 6具有约77%的序列同一性。(B)Nek 7的三维结构，显示了一些重要的结构特征。(C)Nek6的3D结构模型使用Nek7作为模板。相对较长的区域，其中相不能通过X射线晶体学解决[86]。因此，同源性建模在这些区域中可能不那么准确，尽管靶模板序列的高度同一性使得整个模型似乎是合理的。结果揭示了大多数的氨基酸是在一个与右手α-螺旋X一致的α-螺旋分布，因此很可能是一个质量可靠的模型）。通过使用Nek7和Nek6的Z分数分别为7.59和7.02与模板进行比较来进一步验证Nek6结果的预测模型及其质量评估，这表明残基能量与对能量、组合能量和表面能一起都是负的，并且与模板具有相当的表面能亲和力。总之，在验证过程中未观察到抗体，这表明蛋白质的模型良好。3.5. 蛋白质对接Nek6的3D同源性模型和DWNN结构域的NMR结构之间的对接分析，导致25个模型，具有能量和疏水平衡的有利成员数，范围从106到7。RISK Pro算法采用1000个能量最低的模型。然后，它在9 μ m的空间内旋转配体（DWNN），并计算中心模型的这些新变体的数量，这些新变体是用于对接的可行位置。然后这些被表示为模型的集群，并且可行模型的数量被称为集群或成员数量。然后，模型按其成员编号进行能量最有利的模型有135个成员，的中心对接模型（-679.6），最低能量配置（719.3）比中心对接模型中成员数最多的模型（176个成员的能量544.1, 最低 能源 配置 659/01）。然而，在这方面，的使用的的蛋白交互计算器Z. Mbita等人医学信息学解锁23（2021）1005227生物信息学软件[60]显示，这些模型在6 μ A截止值内没有形成键。换句话说，它只搜索可能在相互作用的蛋白质侧链或主链之间形成的可能的键，这些侧链或主链可以在彼此的6A内。具有预测相互作用的能量最有利的模型有91个成员，中心对接模型的能量（-636.6），最低能量构型（-681.3）。 该对接模型如图所示。 五、3.6. RBBP 6亚型3突变体的同源性建模和磷酸化预测使用DWNN的NMR结构进行RBBP 6同种型3的两种突变形式的同源性建模。此处获得的结果未显示突变体和野生型蛋白质之间的许多结构差异。野生型DWNN含有7个β-图五. Nek6模型和DWNN NMR结构之间相互作用的对接模型：DWNN与NEK6的区域相互作用，该区域对应于NEK7的ADP结合位点。(A)模型的带状结构，显示了DWNN结构域的侧链和参与相互作用的NEK6蛋白，其显示为棒状结构。(B)互动的空间填充模型单片和一个阿尔法螺旋X.氨基酸取代在突变体S25A和T49A不会引起蛋白质3D结构的重大变化。残基25位于β1和β2之间。然而，该区域的蛋白质结构没有变化。残基49位于β4 β折叠的起始处。然而，氨基酸取代不改变蛋白质的结构。 尽管如此，突变体与NEK6的相互作用非常不同，如图6A所示。虽然S25A与野生型蛋白质在大致相同的区域相互作用，但T49A结合蛋白质的不同部分，并且两种突变体都以自身的不同区域结合蛋白质。这些对接模型也比与野生型的对接模型在能量上更不利（表2）。这表明RBBP 6同种型3的这些突变形式与Nek6的结合效率低于野生型蛋白。对DWNN可能被磷酸化的残基的预测显示了13个可能的磷酸化位点（图6B）。位置25处的丝氨酸是预测被磷酸化的区域之一。该残基在突变体中被丙氨酸取代。当突变体与NEK 6结合时，预计该丙氨酸与NEK6相互作用3.7. RBBP 6亚型3与不同细胞周期调控因子和泛素连接酶使用RMBPro来模拟RBBP 6同种型3与先前鉴定为与RBBP 6同种型3相关的12种鉴定的细胞周期调节剂（图7）和鉴定为与RBBP 6同种型3相互作用的泛素连接酶（图8一旦获得这些模型，使用蛋白质相互作用计算器工具（PIC）[60]对其进行分析 预测在6 μ g截止范围内形成相互作用物的那些蛋白质示于表3中，并示于图1A和1B中。7和8丢弃在6 μ m截止值内未显示任何键的那些模型。细胞周期调节因子与能量最有利的相互作用都涉及通过在细胞分裂过程中与微管相互作用来调节细胞分裂这些包括TUBG 1，NDC 80，MZT 2和CHMPB 4。MAX是促进细胞周期进程的转录调节因子。GINS 2是一种蛋白酶体成分，可抑制细胞周期的进展[88]。与RBBP 6同种型3相互作用的具有预测的键形成的那些E3连接酶显示在图8中。这些蛋白质中的三种是E2连接酶UBE2L2、UBE2Q1和UBE2L2。剩下的两个都是E3连接酶，RNF115和RLIM。的 剩余 细胞 周期 监管机构 和 泛素 连接酶是使用RT-PCR Pro与RBBP 6同种型3对接。这些相互作用不具有参与可能的疏水相互作用、氢键和静电相互作用的残基，如使用蛋白质相互作用计算器（PIC）网络服务器所确定的。4. 讨论和结论本文揭示了RBBP6的进一步相互作用，这是癌症的重要标志。在这里，我们显示了蛋白Nek6与人RBBP6同种型3，特别是DWNN结构域的相互作用。了解这些蛋白质相互作用对于揭示RBBP6的潜在机制及其在RNA剪接、泛素化和细胞周期控制中的作用是重要的。与大多数与DNA相互作用并发挥E3泛素连接酶作用的蛋白质类似，RBBP 6含有负责泛素化的RING指E3连接酶结构域。RBBP6的全长同种型通常在大多数癌症中过表达并有助于增殖。在结肠直肠癌、乳腺癌和宫颈癌等癌症中，RING指E3连接酶结构域通常与转移和预后不良相关[89，90]。Xiao等（2019）证明RBBP6激活NF-κB通路诱导[90]第90话相比之下，RBBP 6同种型3/DWNN显示在一些癌症中下调并具有抗增殖活性。RBBP 6同种型3的表达减少与G2/M细胞周期停滞有关，其过表达对G2/M细胞周期停滞具有相反的作用。Z. Mbita等人医学信息学解锁23（2021）1005228见图6。NEK6与RBBP6亚型3突变体之间相互作用的对接模型和RBBP6亚型3中预测的磷酸化位点。(A)RBBP6同种型3的突变体中的氨基酸取代不改变蛋白质的3D结构。然而，这些变化导致NEK6和突变体之间（B）RBBP 6同种型3的氨基酸序列，显示预测的磷酸化位点。表2Nek6和RBBP6同种型3对接模型的能量和模型编号细胞周期通过允许进展[22，89]。由于其参与细胞周期调控，这些结果表明靶向RBBP 6亚型3磷酸化可以作为潜在的治疗靶点集群中心最低能源集群中心最低能源治疗癌症在这项研究中，我们能够显示Nek6和RBBP6-3电话：+86-636.6-681.3 +86-622.2-759.7DWNN域。NEK 6是一种参与染色体分离并促进细胞周期进程的蛋白激酶。已知的是S25A 86-552.9-635.5 106-618.7-699.1T49A 82-578.3-586.2 106-619.5-691.8磷酸化RBBP6 [66，91]。因此，这种相互作用可能导致RBBP6同种型中的DWNN结构域被Nek6磷酸化。RBBPBBP6同种型1的磷酸化促进细胞凋亡。见图7。与RBBP 6亚型3相互作用的细胞周期调节剂。这些是用于这些细胞周期调节剂与RBBP 6同种型3相互作用的RMBPro对接模型的表示。（A）TubG1、（B）NDC 80、（C）MZT 2和（E）CHPB 4都通过在细胞分裂期间与微管相互作用来调节细胞周期(D) GINS 2和（F）MAX与DNA复制复合物相关（G）PSME 1是细胞周期进程的负调节剂Z. Mbita等人医学信息学解锁23（2021）1005229见图8。与RBBP 6同种型3相互作用的泛素连接酶。这些是这些泛素锂离子与RBBP 6同种型3相互作用的RMBPro模型的表示。其中三种是E2连接酶（A、C和D），而其余两种是E3连接酶（B和E）。增殖我们的研究确定了RBBP6亚型3序列中17个可能的磷酸化位点。RBBP6与癌症的关联已得到充分证明。Nek6也已知在癌症进展中起重要作用，并且通常在大多数晚期癌症如乳腺癌、肝癌、前列腺癌、胃癌和结直肠癌中上调[89]。Nek6以前被认为与转化生长因子β有关，（TGFβ）途径。Zuo等使用肝细胞癌作为模型疾病，表明Nek6的过表达抑制了跨膜转运。TGFβ通路介导的转录活性和细胞进展的停滞[92]。Nek6的过度表达归因于增强的通过抑制G2/M细胞周期阻滞来抑制细胞进展。靶向Nek6的表达可能具有相反的效果[93]。 此外，Jee等人证实，Nek 6的下调是DNA损伤后激活G2/M细胞周期停滞所必需的[94]。我们的结果表明，RBBP 6亚型1在其/DWNN结构域被Nek 6磷酸化促进细胞增殖，因为在DWNN结构域中观察到降低的亲和力。变种人由于RBBP 6亚型3的核定位增加，以响应细胞应激，我们认为，这种亚型作为一个调节剂通过其DWNN结构域与Nek 6和抑制Nek 6的能力，通过其DWNN结构域与RBBP 6亚型1相关联。这些结果表明RBBP 6亚型3/DWNN和Nek 6的相互作用可以作为新的抗癌治疗的靶点我们已经确定了其他11种参与细胞周期调控的蛋白质通过分析这些蛋白质与DWNN相互作用的MIPPro模型，鉴定出7个与DWNN形成键的键长在6 μ m以内。两个相互作用能量最低的蛋白质都是在细胞增殖过程中与微管相关的蛋白质。微管蛋白γ 1（TUBG 1）是微管蛋白家族的一员，在中心体与微管结合，促进微管形成。这已被证明会导致细胞分裂和细胞周期的进展[95]。RBBP6可以防止这种蛋白质的降解，允许蛋白质在细胞内保持活性。NDC 80是动粒的组分，并与微管结合。它参与纺锤体检查点信号传导，检测染色体分离是否正确进行。已知NDC 80与NEK家族的成员相互作用。这可以提供关于RBBP 6同种型3与该蛋白结合所执行的功能的线索[96，97]。其中两种蛋白质GINS 2和MAX与DNA复制复合物相关。GINS 2通过促进复制叉的延伸来促进DNA复制最近，GINS 2已被确定为宫颈癌的生物标志物，并与癌症进展有关GINS 2在DNA复制和细胞增殖中起着至关重要的作用，在低水平GINS 2的患者中观察到细胞增殖，并且还抑制转移[88，98]。MAX是一种跨-转录调节因子，并与其他转录因子结合，促进或抑制特定基因的转录。取决于MAX结合的转录因子，可以上调或下调的靶基因之一是Myc癌基因[99]。 RBBP6亚型3与MAX相关的作用需要确定，因为这种亚型通常作为癌症抑制剂。该组中的最后一种蛋白质是蛋白酶体组分，蛋白酶体激活剂亚基复合物1（PSME 1）。这种蛋白质是细胞周期的负调节因子。它和PSME家族的其他成员被发现在皮肤癌[100]和急性淋巴细胞白血病[101]中上调。在未发表的数据中，RBBP 6同种型3在Jurkat细胞中高度表达，这种相互作用需要进一步研究。在已鉴定的细胞周期调节蛋白中，在6 μ M的临界值内，Polo样激酶2（PLK 2）蛋白主要在细胞周期的G2/M期表达。它积极参与有丝分裂、胞质分裂和中心粒复制[102]，在有丝分裂进程中的功能与Nek 6相似。抑制Nek6会阻碍细胞周期相关活动，并可能导致有丝分裂停滞、纺锤体缺陷和细胞凋亡[103，104]。除了细胞周期调控，癌症中过表达的蛋白质可以作为潜在的生物标志物或药物开发的靶点。其中一种蛋白质Smad3已被证明在癌症中被下调。Smad 3参与TGF-β信号通路，在癌症中已得到证实。Daly等人证明，Smad3在高度增殖性癌细胞中的作用[105]。通过激活Smad3的上调，肿瘤增殖可以被控制，TGF-β信号通路的激活。RBBP 6同种型3与E3和E2连接酶两者的相互作用并不令人惊讶。如果存在几乎完全由泛素样DWNN结构域组成的蛋白质意味着这是一种新型修饰（DWNN化），那么DWNN结构域将结合E2和E3连接酶作为DWNN化链的一部分，类似于泛素化链。或者，DWNN与这些蛋白质的结合可用于阻断泛素与它们的结合以这种方式，RBBP6同种型3可以防止泛素化和由此产生的蛋白质降解。总之，这些蛋白质与RBBP 6同种型3/DWNN的潜在相互作用表明其在肿瘤进展中的作用，Z. Mbita等人医学信息学解锁23（2021）10052210表3与RBBP 6同种型3相互作用的细胞周期调节因子和泛素连接酶的CD3Pro对接结果，其中鉴定了可能的相互作用残基。蛋白Uniprot登录PDB ID平衡评分静电评分集群中心最低能耗集群中心最低能耗NEK6 Q9HC98 135-679