软骨组织工程在骨科和头颈部重建中的应用及未来方向

工程3（2017）28研究组织工程软骨组织工程的研究进展--我们的经验和未来的方向刘宇a，b，c，周广东a，b，c，曹亦林a，b，d，*a上海市组织工程重点实验室，上海交通大学医学院附属上海市第九人民b国家组织工程研究中心，上海200241c潍坊医学院整形外科医院整形外科研究所，山东潍坊261041d中国医学科学院整形外科医院，北京100144ARt i clEINf oA b s tRAC t文章历史记录：2016年10月31日收到2017年1月12日修订2017年1月13日接受2017年2月21日在线发布保留字：软骨组织工程临床前免疫活性动物研究临床翻译骨科手术头颈部重建鉴于软骨损伤后有限的自发修复，对软骨再生的组织工程方法的需求正在增长组织工程软骨有两个主要的应用一种是在矫形外科中，其中工程化软骨通常用于修复关节或半月板中的软骨缺损或损失，以恢复关节功能。另一种是用于头颈部重建，其中工程化软骨通常用于修复耳廓、气管、鼻、喉或眼睑中的软骨缺损或损失工程化软骨在一种应用中所面临的挑战与工程化软骨在另一种应用中所面临的挑战完全不同因此，产生软骨的工程策略的重点通常对于每个应用是相当不同的临床前动物研究和工程化软骨的临床转化的状态对于每种应用也处于不同的这一重新审视的目的是提供一个意见片的挑战，目前的发展，和未来的方向，软骨工程的两个应用。© 2017 The Bottoms.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版这是CC BY-NC-ND下的开放获取文章许可证（http：//creati v ecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。1. 介绍骨科部位和头颈部区域的腕关节缺损通常由创伤、癌症切除、衰老或先天性疾病引起由于软骨是无血管的、无神经的和淋巴的，并且仅包含稀疏的单细胞类型（软骨细胞）的群体，因此其在损伤后再生的能力受到阻碍[1，2]。软骨修复的主要传统手术包括微骨折（骨髓刺激）[3]、自体移植[4]和自体软骨细胞植入（ACI）[5]。虽然在某些方面是成功的，但这些方法都有局限性，例如修复区域的不匹配特性、缺乏整合和供体部位发病率[6组织工程提供了一种前瞻性的替代策略，通过将软骨细胞接种到生物可降解支架中或生物可降解支架上，以工程化软骨用于缺损修复[9]。在骨科应用中-为了修复关节软骨的损伤，工程软骨通常用于修复关节或半月板的缺损，以恢复关节的承重功能并缓解疼痛。在头部和颈部应用中，出于美学或功能目的，软骨通常被工程化用于耳廓、气管、鼻、喉或眼睑的修复或重建工程软骨在每种应用中所面临的挑战都是完全不同的。在矫形应用中，工程化软骨需要与邻近的天然软骨以及在许多情况下与软骨下骨整合。工程化软骨的机械性能应始终与邻近组织的机械性能相匹配，以便能够在生物力学困难的关节环境中存活和发挥功能[8]。工程软骨还需要应对退行性伤口中的炎症介质。然而，在头颈部应用中，工程化软骨移植物通常需要* 通讯作者。电子邮件地址：yilincao@yahoo.comhttp://dx.doi.org/10.1016/J.ENG.2017.01.0102095-8099/© 2017 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。 这是CC BY-NC-ND许可证下的开放获取文章（http：//creati v ecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect工程杂志主页：www.elsevier.com/locate/engY. Liu等人/工程3（2017）2829在软骨形成上是稳定的，具有极好的生物相容性，使得它们可以在皮下或肌内植入部位存活并发挥作用，所述植入部位缺乏软骨诱导因子并且以急性免疫应答为特征。在许多情况下，工程化软骨还需要具有大体积和/或专门功能的特定形状。因此，产生软骨的工程策略通常对于每个应用都是完全不同的。临床前动物研究和工程化软骨的临床转化的状态对于每种应用也处于不同的水平。本课题组致力于软骨组织工程的研究已超过20年。我们的专业和研究重点涉及使用不同种子细胞来源进行不同类型的修复的软骨体外再生软骨，和他们的临床前大动物评价。在这篇综述中，我们提供了种子细胞策略，支架设计和临床前动物研究的发展，以及临床翻译的现状，这两种应用的意见。我们还总结了遇到的挑战和未来的要求。2. 组织工程化软骨在骨科重建中的由于预期寿命和青年肥胖率呈上升趋势，预计骨关节炎（OA）的患病率将稳步增加[10，11]。与此同时，运动损伤的发生率也在不断上升。因此，工程化软骨的主要应用是修复由创伤或病理损伤引起的软骨缺损的矫形实践因为最重要的功能 骨科软骨的主要功能是承重，理想的工程化软骨应具备：①不仅与软骨下骨结合，而且与邻近软骨结合，以实现稳定的载荷分布和力学传递;②匹配邻近天然软骨的力学性能，以避免因应变差异引起的组织退化; ③在大变形和运动下能够承受载荷;并重现独特的带状结构，以重建天然软骨的结构-功能关系。在一篇综述论文[8]中已经彻底描述了工程化生物力学合适软骨的挑战。此外，工程化软骨应该能够应对退行性软骨的炎症环境。在过去二十年中，为满足这些标准而开展的研究活动一直在持续。目前正在探索最佳的细胞来源和支架已经进行了临床前大动物研究许多用于骨科重建的工程软骨已经实现了临床转化甚至进入市场。然而，尽管在该领域中不断取得进展，但没有研究活动产生可以完全模仿天然软骨的特性和结构的软骨。2.1. 组织工程软骨的种子细胞选择用于骨科应用的工程化软骨的植入部位通常在关节内空间内，其中存在细胞因子和机械刺激方面的软骨诱导线索因此，存在几种不同的种子细胞选择：软骨细胞[12]，来自不同来源的间充质干细胞（MSC）[13，14]，（诱导的）多能干细胞[15]，甚至成纤维细胞[16]被报道为种子细胞候选者，以工程化软骨用于骨科应用。但是，没有达成共识， 是目前骨科软骨工程的最佳细胞来源。我们的团队主要关注两种临床上最适用的种子细胞来源：软骨细胞和MSC。2.1.1. 软骨细胞软骨细胞是软骨特异性细胞外基质（ECM）产生所必需的常驻软骨细胞，代表了软骨工程种子细胞的合理选择。从关节表面分离软骨细胞是困难的，并且会引起继发性损伤，导致OA。因此，研究人员考虑使用非关节然而，异位软骨细胞是否能产生所需类型的软骨（如透明软骨）并在缺损愈合过程中发挥作用仍不清楚。来自OA软骨的软骨细胞也已作为种子细胞候选物进行了测试[21为了使用软骨细胞作为种子细胞来源，研究人员需要通过例如3D微载体悬浮培养[24，25]、软骨细胞分选[26]、细胞因子刺激[27]或降低氧张力[28]来处理去分化问题，尽管过度扩张的软骨细胞可能失去其再分化的能力[29]。此外，正如我们之前的研究所证实的，软骨细胞可能无法在骨软骨缺损的软骨下骨区域形成骨组织（图1）[12，30]。2.1.2. 间充质干细胞为了克服软骨细胞的局限性，MSC逐渐成为许多研究者的关注焦点[31]。MSC可以从许多不影响软骨活性的来源中收获，在多次扩增后保持多能性，并且可以分化产生软骨和骨，从而使骨软骨缺损的组织特异性修复成为可能（图1）[30，32]。骨髓间充质干细胞的免疫抑制特性在其软骨形成承诺后仍然保持，使得现成的同种异体应用变得实用[33，34]。然而，使用MSC作为关节软骨修复的替代细胞来源也存在一些问题。图1.一、聚乙醇酸（PGA）支架分别负载软骨细胞和骨髓基质细胞（BMSCs）修复猪自体骨软骨缺损。两种细胞均实现了表面光滑的软骨修复。软骨细胞在软骨下区未能实现组织特异性修复。HE：苏木精和伊红; NC：天然软骨; IF：界面;RC：再生软骨; CB：软骨下骨。其中一些数据发表在参考文献中。[12、30]。30Y. Liu等人/工程3（2017）28限制，例如：骨髓或其它供体组织中MSC的细胞数量低;需要对其进行仔细鉴定;存在几种细胞亚群;已经定型的细胞的含量;耗时的软骨形成分化过程;软骨形成表型的不稳定性;以及其它谱系中不受控制的分化，特别是考虑到损伤软骨中炎性介质的影响[18]。此外，据报道，与由原代软骨细胞产生的工程化软骨相比，由MSC工程化的新软骨在表观遗传学上与自体软骨的相似性更低[35]。由于这些限制，在广泛的临床应用中使用MSC的安全规定是困难的。2.2. 组织工程软骨用于骨科重建的支架材料选择2.2.1. 水凝胶支架在骨科应用中，水凝胶首先通过注射或关节镜应用于局部软骨病变的微创修复作为软骨工程的支架材料，水凝胶具有许多优点：它们可以表现出与关节软骨相似的机械、溶胀和润滑行为[6];它们的粘弹性性质有助于机械载荷的转移[6];并且它们允许它们的加载细胞呈现球形形态，这是软骨形成表型的特征[36，37]。载有细胞的水凝胶也被广泛研究用作生物墨水，用于具有仿生结构和功能的软骨的3D生物打印[38，39]。在过去的十年中，已经设计了光敏[40-水凝胶与其他类型支架的组合应用受到鼓励[50]。然而，目前新型水凝胶的设计主要集中在材料性质的某些方面，因此无法复制整个软骨形成生态位的复杂性。因此，加强材料科学家与组织工程其他相关领域专家的合作对于开发具有平衡机械性能、导电性、降解速率、生物相容性和软骨诱导性能的水凝胶至关重要。将新型水凝胶与3D生物打印等先进技术相结合也是一个有前途的趋势[51]。2.2.2. 固体支架关于水凝胶支架的液体或凝胶形式，许多研究人员（包括我们的小组）更喜欢使用固体支架来工程化软骨，用于大的、不含缺陷的修复。固体支架也可以分为天然和合成衍生物。天然支架如胶原海绵、脱细胞软骨和小肠粘膜下层（SIS）具有生物功能和信号线索的益处。其中，胶原海绵是目前临床应用最广泛的软骨修复支架。合成材料易于加工，具有极好的批次一致性，并且其机械和化学性能可以很容易地定制。由于关节囊可以阻断一些免疫反应细胞，因此可以将一些可能在皮下部位诱导严重宿主反应的合成材料用作骨科应用的组织工程支架[52]。一个例子是聚乙醇酸（PGA），它已被证明是许多类型细胞的极好载体，并且已被我们的小组广泛用于体外和体内软骨工程，使用不同类型的种子细胞进行关节软骨损伤修复或半月板重建[12，16，30]。为了利用不同支架的优点，将天然来源的材料与合成的脚手架成为一种合理的方法。多相支架的应用正在出现，特别是在骨软骨修复的尝试中[53-55]。然而，在临床应用之前，这些生物材料的有效性必须通过长期的临床前大动物研究来证明。2.3. 组织工程软骨用于骨科重建的临床前免疫活性动物研究是评估工程化组织能否应用于临床的重要步骤。在过去的二十年中，我们成功地修复了猪的软骨或骨软骨缺损[12，30]。我们还修复了狗的半月板缺损（图）。 2、未公开数据）。对于骨科应用，我们主要根据其关节解剖结构和软骨体积（面积和厚度）选择动物模型。根据Ahern等人的建议[56]，还应考虑其他标准，如处理难度、饲养要求、成本、尺寸和骨骼成熟时间。除了工程软骨的质量外，许多其他因素也会极大地影响大型动物研究的结果。例如，在我们最近尝试修复猪模型中的骨软骨缺损时，我们未能获得合理的结果，因为我们通过在一只动物中创建太多缺损而将工程车有效固定到缺损中也很关键，并且不应引入影响研究设计的其他因素。事实上，由于太多因素可能影响临床前动物研究的结果，不同研究之间的比较变得非常困难。因此，应建立研究设计和结局参数（如组织学、生物化学和生物力学评价）的标准化[56]。此外，尽管大型动物研究为预测新治疗策略的疗效提供了有价值的数据，但应始终记住，没有动物模型允许直接应用于人类[52]。例如，在大型动物模型中创建的大多数缺损是新鲜伤口;然而，在临床环境中，我们需要处理具有受干扰的局部环境的慢性缺损，该环境与新创建的新鲜伤口中的环境完全不同[57]。2.4. 组织工程软骨在骨科重建中的临床应用组织工程原理目前主要以ACI的形式或使用类似技术应用于临床应用[58]。相关产品如Carticel®和Hyalograft® C已经进入市场，用于治疗创伤性视网膜病变。目前，临床上可用的组织工程软骨产品已在最近的综述论文中进行了全面描述[59]。然而，尽管在技术上有所改进，但ACI型技术未能证明比旧技术（如微骨折）具有显著的临床受益，可能较大病变除外[58]。此外，这些技术无法治疗大的缺损或与晚期疾病（如OA）相关的缺损[60]，并且没有显示出重建整个结构单元（如关节头或半月板）的潜力。因此，研究人员正在研究更先进的技术，最终目标是安全，标准化，具有成本效益和符合GMP的大规模软骨移植物生产[60]。不过由于由于难以评估工程化软骨的质量，包括其安全性、成本效益和过程中的并发症，软骨组织工程的大多数新发展尚未转化为可测量的临床收益[58]。Y. Liu等人/工程3（2017）2831图二. 用载有软骨诱导成纤维细胞的PGA支架修复自体犬半月板缺损。成纤维细胞用软骨衍生的形态发生蛋白-1（CDMP 1）进行软骨诱导，并接种到一个漏斗形的PGA支架中，未诱导的细胞作为对照。植入后3个月，诱导组的样品产生的半月板在大体外观、组织学染色和显微结构方面类似于天然半月板，这通过扫描电子显微镜（SEM）观察显示。3. 组织工程化软骨在头颈部重建中的除了矫形应用之外，工程化软骨还可用于头颈部重建，以治疗耳廓、鼻子、眼睑、气管等的软骨缺损本课题组主要研究耳廓重建和长段气管重建，这是头颈部应用中最具代表性和最困难的病例，可为其他应用提供有价值的参考。与用于骨科应用的工程化软骨不同，用于头颈部重建的工程化软骨通常需要具有复杂的形式;它们的植入部位是非软骨形成的，并且具有侵袭性免疫反应的特征，使得种子细胞和支架的选择非常有限。出于同样的原因，工程化耳廓或气管的临床前评价和概念验证临床研究是有限的，并且尚未看到广泛的3.1. 组织工程化软骨用于头颈部重建的软骨细胞是最受欢迎的种子细胞选择，neer软骨用于头颈部重建。其受欢迎的一个原因是，与从膝关节分离关节软骨细胞相比，增殖软骨细胞可以容易地从耳廓或鼻中隔分离，而不会对供体组织造成功能性损伤[61]。另一个重要的原因是，从干细胞工程软骨是不稳定的，头颈部皮下或肌内植入部位的骨化[62，63]。在这种情况下，软骨细胞与MSCs的联合培养可能是一种更合理的种子细胞策略。3.1.1. 软骨细胞软骨细胞通常从鼻中隔（透明软骨）或耳廓（弹性软骨）分离特别是，对于小耳畸形患者的耳廓重建，否则将被丢弃的变形耳软骨提供了理想的种子细胞来源，而不会损害健康的软骨[64，65]。软骨细胞传统上被认为具有低增殖能力。然而，研究人员发现，从鼻中隔或耳廓分离的软骨细胞比以前预期的更具增殖性[66，67]。更重要的是，由这些软骨形成的工程软骨32Y. Liu等人/工程3（2017）28细胞在皮下环境中保持稳定的表型和功能而没有收缩或骨化。尽管它们是增殖性的，然而，这些细胞仍然具有去分化问题。我们发现小耳软骨的软骨细胞在单层培养的第1代和沉淀培养的第2代停止表达II型胶原和聚集蛋白聚糖[66]。因此，为了实现足够数量的功能性软骨细胞，使去分化细胞再分化的程序是必要的。然而，这些程序可能涉及多种化学或细胞因子的应用，这可能会为未来的临床应用带来安全性问题。3.1.2. 间充质干细胞由于头颈部应用中的非软骨形成植入部位，其中干细胞倾向于终末骨化，只有有限数量的报告描述了在皮下部位使用个体MSC的稳定软骨的成功再生[62，68]。MSC与一小部分软骨细胞的共培养证明了在非软骨形成环境中形成稳定软骨的有效种子细胞策略[69我们的小组已经成功地在裸鼠模型中使用骨髓来源的MSC与小耳软骨细胞共培养来产生人耳状软骨[66]。共培养可以减少对软骨细胞的需求，最大限度地减少软骨细胞收获留下的供体部位发病率。还假设MSC可能能够调节局部免疫环境，降低工程化软骨被皮下宿主反应攻击的风险。共培养促进稳定软骨形成的机制有许多方向。我们的研究小组已经证明了绿色荧光蛋白（GFP）标记的MSC在与软骨细胞共培养期间的直接软骨形成，并说明了软骨细胞产生的可溶性因子是MSC软骨形成的关键原因[70]。另一方面，MSC的营养作用也被证明可促进软骨细胞的增殖和ECM产生[72，73]。通过间隙连接的直接细胞-细胞接触和通信也可能在MSC的软骨形成中发挥作用然而，哪种机制是主导机制的问题还有待确定。3.2. 组织工程化软骨用于头颈部重建头部和颈部应用的皮下或肌内植入部位的特征在于急性宿主反应。因此，最成功的皮下软骨再生是基于无支架软骨细胞悬浮液[75，76];工程软骨片[77，78];或具有极好生物相容性的材料，如胶原蛋白[79，80]。为了在皮下环境中为干细胞的稳定软骨形成提供软骨形成线索，脱细胞软骨细胞ECM或软骨的应用也是常见的选择[81]。由于头颈部重建中的许多情况需要工程化软骨具有特定的形式，例如耳廓、气管或鼻子，因此优选具有强机械性能的合成支架，其易于成形并且在培养期间不会收缩在过去的20年里，我们的团队一直在使用PGA来工程化软骨，用于耳廓和气管重建为了克服PGA诱导的炎症反应，我们提出了体外预培养，以便在植入前使PGA支架充分降解[82，83]。研究人员还设法通过使用缓慢或非降解材料作为内核来支撑形状，然后用生物相容性天然材料包裹内核作为软骨形成的细胞载体，从而产生具有强大机械性能和极好生物相容性[80，84]。然而，引入缓慢或非降解材料作为内核使情况复杂化，因为难以确定所产生的嵌合移植物是具有生物活性的工程化组织，还是仅仅是支撑形状的装置或假体。可能还需要非降解内芯来处理挤出的可能性因此，迫切需要一种具有良好机械性能、易于成型控制和优异生物相容性的支架 这种支架可以通过改变支架的当前特性来制造-例如，通过免疫调节药物的受控释放[48，85]。鉴于未来的替代方案，目前最先进的3D生物打印工艺可以提供具有结构完整性的软骨的一步生成[86]。3.3. 组织工程软骨修复头颈部缺损的目前关于头颈部重建工程软骨的报道多处于体外或裸鼠研究阶段。只有有限数量的报告描述了在免疫活性动物中成功设计耳廓或气管的尝试[80，82，87]。缺乏成功的一个主要原因是皮下或肌内植入部位的急性免疫反应会攻击使用生物相容性不佳的支架构建的植入移植物[83，88]。对于头部和颈部重建，工程软骨需要具有特定形式（如耳廓）或功能的大尺寸，这进一步使情况复杂化。人类耳状软骨的工程就是一个例子。早在1997年，就报道了在裸鼠中成功产生人耳状软骨[89]。然而，直到最近才报道成功产生全尺寸的人耳状软骨，这次是在绵羊模型中[80]。结构调整只是迈向成功的一步。许多病例有严格的功能需求。气管重建提供了一个例子：我们的小组在2009年报告了在自体家兔中成功皮下生成管状软骨[82]。然而，当使用这种管状软骨修复成年兔的节段性气管缺损时，我们遇到了气道狭窄（由肉芽组织过度生长引起）、气道塌陷（由软骨软化引起）和粘膜嵌塞（主要由缺乏上皮细胞引起）的问题在气管缺损的功能性修复中，我们应用硅胶支架抑制肉芽过度生长和防止气道狭窄，然后采用肌内植入和带蒂肌瓣移植建立稳定的血供，以维持管状软骨结构和促进上皮化。通过结合这些策略，我们最终实现了兔节段性食管缺损的长期功能重建（图3）[87]。然而，尚未在临床前山羊模型中重现该结果，因为山羊具有更急性的免疫系统，并且术后护理要求更高[83]。显然，用于头颈部重建的工程化软骨的临床前动物研究工程技术需要改进以提供大体积、强机械性能和极好生物相容性的软骨与外科医生的密切合作也至关重要，因为头颈部的解剖结构很复杂。3.4. 组织工程软骨在头颈部缺损修复中的应用最近值得注意的关于头颈部工程软骨的临床事件包括：Y. Liu等人/工程3（2017）2833图三. 带蒂组织工程气管功能性重建兔气管缺损的实验研究。(a)组织工程化气管;（b）由胸骨舌骨肌包裹用于血管化的组织工程化气管;（c）用于用硅管作为支架修复气管的节段性缺损的带肌肉蒂的气管;（d）重建4周后的组织工程化气管;（e）（d）的HE染色;（f）（e）的红色框的高倍放大;（g）重建后6个月后的组织工程化气管的横截面，显示与天然气管的良好界面愈合（黄色框：界面，蓝色框：工程化气管）;（h）HE染色，显示重建后2周的上皮向内生长;（i）HE染色，显示重建后8周的上皮向内生长一些数据已经公布[87]。• 组织工程化气管：2008年，Macchiarini等[90]报道了组织工程化、基于干细胞的脱细胞气管的首次临床应用，用于治疗一名30岁女性; 2014年报道了5年随访结果[91]。在避免需要供体气管的替代努力中，研究者还利用纳米复合材料作为支架，用于患者使用的工程化的基于干细胞的气管[92，93]。然而，这些方法的有效性和真实性却备受争议。• 鼻前叶缺损的组织工程：2014年，Fulco等人[94]报道了一项首次人体试验，其中将鼻中隔软骨细胞接种到纤维胶原支架上，以工程化软骨片，用于修复5名患者的鼻前叶缺损目前还没有报道基于组织工程方法的全• 耳廓重建中的组织工程：2009年，Yanaga等人[75]描述了一种两阶段ACI型方法，将大量扩增的小耳软骨细胞注入患者的下腹部以形成软骨块，然后将其手工雕刻成耳廓重建的耳框架。目前还没有报道基于细胞和预成型生物可降解支架直接工程化人耳软骨用于临床应用。这里列出的努力只是概念验证的临床翻译;大规模的临床应用还有很长的路要走。4. 结论经过20多年的不断发展，车辆工程取得了显著的进步.许多基础生物工程研究已经取得突破，正在进行的临床研究数量正在增加，使组织再生的前景更接近现实。然而，将概念验证研究转化为临床前或临床研究的过程带来了不断升级的挑战。对于骨科应用，其中组织工程可能更接近于广泛的临床应用，应确保工程化软骨与软骨下骨和相邻软骨的促进整合。工程化软骨的机械性能也应该与邻近组织的机械性能相匹配，以便提供即时和长期的承重功能。还应考虑OA或慢性伤口的恶劣退行性环境对于头颈部应用，概念验证临床翻译正在蓬勃发展，但尚未看到广泛的临床应用。工程软骨应该是非常生物相容的，以避免34Y. Liu等人/工程3（2017）28皮下或肌内植入部位的急性免疫反应。此外，工程化软骨应准确地再现重建组织的结构和功能特性。对于这两种应用，现在比以往任何时候都更需要发育生物学、细胞生物学和材料科学专家与外科医生和法规制定者的密切合作，以便将科学理解的范围有效地扩展到实际应用中。遵守道德操守准则刘宇、周广东和曹一林声明，他们没有利益冲突或财务冲突需要披露。引用[1] 作者：Bernhard JC我们应该使用细胞、生物材料或组织工程来进行软骨再生吗？干细胞研究与治疗2016;7（1）：56.[2] Reinholz GG，Lu L，Saris DBF，Yaszemski MJO，软骨重建的动物生物材料2004;25（9）：1511[3] Steadman JR，Rodkey WG，Rodrigo JJ.微骨折：治疗软骨缺损的外科技术临床骨科相关研究2001;391（391增刊）：S362-9。[4] Hangody L，Füles P. 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