工程7：肠道菌群与冠状动脉疾病的微生态学研究

工程7（2021）1715微生态学研究肠道菌群的变化与冠状动脉疾病胡佳璐a，#，姚志峰a，#，唐敏娜a，#，唐春b，#，赵晓凡b，苏喜c，陆丹波a，李秋荣b，王章胜d，严艳a，王泽能e，王伟a复旦大学附属中山医院心内科，上海200032b南京大学医学院附属金陵医院普外科研究所，南京210002c复旦大学附属中山医院检验科，上海200032d复旦大学附属上海市第五人民医院心内科e心血管和代谢科学系，Lerner研究所，克利夫兰诊所，克利夫兰，OH 44195，美国阿提奇莱因福奥文章历史记录：收到2019年2020年4月27日修订2020年5月6日接受在线预订2021年保留字：动脉粥样硬化冠状动脉疾病A B S T R A C T在过去的几年中，在几个有限的队列中报告了冠状动脉疾病（CAD）的肠道微生物群变化。然而，CAD富集或减少的微生物群分类群是否可以重现，值得进一步研究和验证。在这项研究中，招募了78名人类受试者。其中，19例被诊断为冠状动脉无狭窄（对照组，本文称为Ctrl），14例狭窄小于50%（LT 50），45例狭窄大于50%（GT 50）。收集粪便样本，提取DNA进行16S核糖体RNA（rRNA）基因测序。分析操作分类单位（OTU）以识别不同组的特异性分类;接下来，采用多变量逻辑回归来测试所定义的分类是否可以独立地预测CAD风险。我们发现，三角变形菌，梭杆菌，嗜胆汁，放线菌，梭菌XIX富集在Ctrl;普雷沃氏菌科，副杆菌属，和Butyricicoccus富集在LT 50;罗斯拜瑞氏菌属和Butyricimonas富集在GT 50。进一步分析显示，三角变形菌、梭杆菌、嗜胆汁菌和脱硫弧菌科的数量增加分别与CAD风险降低0.26倍、0.21倍、0.18倍和0.26倍相关（p0.05），普雷沃氏菌科数量增加相关增加了5.63倍风险CAD（p0.01）。20种微生物分类群的组合对于LT 50 vs Ctrl、GT 50 vs Ctrl、LT 50 + GT 50 vs Ctrl和GT 50 vs Ctrl + LT 50之间的所有区分实现了高于0.88的受试者操作特征（ROC）曲线下面积。然而，除了拟杆菌外，在我们的队列中未观察到先前报道的在CAD患者或健康对照中富集的微生物分类群。总之，CAD患者显示出与健康对照组不同的微生物类群特征。然而，在CAD中富集的微生物群分类群在不同群组中的不可再现性限制了该特征在早期诊断和预防中的使用。发现仅类杆菌丰度降低是指示CAD进展的可靠标志物。©2021 THE COUNTORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇CCBY-NC-ND许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）中找到。1. 介绍肠道微生物群在人类健康中起着重要作用。数以万亿计的微生物，主要是细菌，居住在人类肠道，并帮助训练人体免疫系统，抑制致病细菌的生长，发酵未消化的纤维以产生短链*通讯作者。电子邮件地址：yan. zs-hospital.sh.cn（Y。Yan），wangz2@ccf.org（Z.Wang）。#这些作者对这项研究做出了同样的脂肪酸（SCFAs），并产生维生素[1由于肠道微生物群衍生的代谢物与靶位点的分离，肠道现在被视为内分泌器官[5，6]。肠道微生物群控制脂肪组织扩张、肠道屏障和葡萄糖代谢[7]。在正常生理条件下，病原微生物和有益微生物处于平衡状态。一旦这种平衡被破坏，这种不平衡就会促进致病微生物的生长，这就是所谓的生态失调，导致肠道微生物群相关疾病，如胃溃疡，炎症性肠病，肥胖，糖尿病，https://doi.org/10.1016/j.eng.2020.05.0252095-8099/©2021 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表工程杂志首页：www.elsevier.com/locate/engJ. - L. 胡志F. 姚，M.-N. Tang等人工程7（2021）17151716·≥非酒精性脂肪肝（NAFLD）、肝硬化、结肠癌、过敏、心血管疾病（CVD）、阿尔茨海默病、自闭症、注意力缺陷/多动障碍（ADHD）和帕金森最近，注意到肠道微生物群参与CVD，并且几个小组报告了肠道微生物群群落与冠状动脉疾病（CAD）的变化[9不同的队列在CVD患者中显示出不同的社区富集。此外，肠道微生物群会随着年龄和饮食而变化[14，15]。因此，肠道微生物群群落与CVD的关联需要用更独立的队列进一步验证，以确定哪些肠道微生物群分类群是与CVD相关的可靠标志物。CVD中涉及的肠道微生物群与代谢物有关;到目前为止，已经研究了肠道微生物群衍生的代谢物，包括三甲胺N-氧化物（TMAO）、对甲苯基硫酸盐和吲哚酚硫酸盐，并报告其与CVD存在机械因果关系[16其他肠道微生物群衍生的代谢物，如SCFA、胆汁酸和植物雌激素，可能对CVD起保护作用[16]。在这项研究中，我们比较了三组基于冠状动脉狭窄的肠道结果表明，肠道微生物群群落结构随着CAD进展而变化，并且几种细菌分类群可以独立地预测CAD风险。此外，我们验证了先前关于CVD肠道微生物群变化的报道。2. 材料和方法2.1. 研究人群2015年4月1日至2015年6月30日，共有381例可疑CAD患者连续入组本研究在这381例患者中，根据以下排除标准排除了273例：胃肠道溃疡、炎症性肠病（克罗恩共108例患者接受冠状动脉造影;最终，78例具有合格粪便样本的患者纳入研究。将78名合格的患者分为三组：没有冠状动脉狭窄证据的参与者（对照组，本文称为对照组）;狭窄证据小于50%的参与者（LT 50）;以及狭窄证据大于50%的参与者（GT 50）。GT 50中的受试者被定义为CAD患者。所有受试者均提供了书面知情同意书。复旦大学附属中山医院伦理委员会批准了所有研究方案（IRB# 327）。在Abbott ARCHITECT平台（Abbott Diagnostics，USA）上测量空腹血糖、脂质谱、酶活性、胆汁酸、尿素等。2.2. 样本采集、DNA提取、16S rRNA基因测序和分类分析从医院的所有患者获得新鲜粪便样品（每份约0.2 g）;然后将其在液氮中快速冷冻并储存在-80°C下直至使用。细菌DNA分离自使用引物F357 + GC/R518扩增基因V4高变区[20]。聚合酶链反应（PCR）产物用Beckman Coulter AMPure珠（Beckman Coulter，USA）纯化。将纯化的DNA的等分试样（50 ng）用于用Ion PlusFragment Library Kit（Life Technologies，USA）鉴定条形码化的文库。样品特异性“DNA分子标签（条形码）”是一种14碱基半随机序列，旨在唯一识别原始模板分子。使用QubitTM dsDNA HS测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific Inc.，美国）。将每次运行的文库稀释 至 26 pmol L 使 用 Ion OneTouch 200 Template Kit v2 （ LifeTechnologies ） 进 行 乳 液 PCR 。 使 用 Ion TorrentTM PersonalGenome Machine（PGMTM）系统和Ion PGM Sequencing 200试剂盒（Life Technologies）在318芯片上进行扩增子文库的测序测序后，通过PGM软件过滤单个序列读数以去除低质量和多克隆序列。将所有PGM质量批准、修剪和过滤的数据导出为FASTQ文件。然后将长度在150和220个碱基对之间且平均质量评分为20的序列与具有耐受性的高同一性聚类数据库（CD-HIT）的操作分类单位（OTU）进行在线比对[21]。使用核糖体数据库项目（RDP）分类器以50%引导阈值对OTU进行分类学分类[22]。遵循的所有程序均符合负责人体实验委员会（机构和国家）的伦理标准。从纳入研究的所有患者获得知情同意书。2.3. 统计分析OTU的生物多样性和丰富度是根据先前报告的公式计算的[23]。分类变量以百分比表示，并使用v2检验在不同组之间进行比较。对于大多数其他研究，除非另有说明，否则使用Student基于网络的基因组分析工具Galaxy可从Huttenhower实验室获得[24，25]，用于分析不同群体之间的微生物群落区分。使用社会科学统计软件包（SPSS）软件（版本11.0.1），开发多变量logistic回归模型，计算丰度高于中位数与低于中位数的每个分类群的CAD患病率的比值比（OR）和95%置信区间（95% CI）对个体传统心脏危险因素或Framing-ham危险评分和肾功能进行了调整采用Hosmer-Lemeshow拟合优度检验和SPSS软件计算受试者工作特征曲线下面积（ROC曲线下面积），评价多变量二元Logistic回归分析的总体预测值在门、纲和属水平上的微生物分类群的相对丰度由安装有ggplot2包的R程序（版本3.6.2）绘制。采用单因素Kruskal-Wallis方差分析（ANOVA）比较3种CAD表型之间Chao 1指数、Shannon指数、Simpson指数和均匀度指数的差异。采用Wilcoxon秩和检验比较两组间微生物相对丰度的差异。采用MetaboAnalyst进行主成分分析（PCA）和偏最小二乘判别分析（PLSDA）使用QIAamp DNA Stool Mini Kit（QIAGEN，USA）的粪便，如下-制造商的指示。 16S核糖体RNA（rRNA）yhttp://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/。J. - L. 胡志F. 姚，M.-N. Tang等人工程7（2021）17151717·[26]第 10 段。b 多样性通过Bray-Curtis 相异度与排列方差分析（ PERMANOVA ） 来 确 定 ， MicrobiomeAnalyst [27 ， 28] 使 用Bray-Curtis相异度定义的b用R程序分别用pcaMethods和pls软件包计算主成分分析的预测优度（Q2）和拟合优度（R2对于所有统计检验，认为p0.05具有显著性。所有方法均按照相关指南和法规进行。3. 结果3.1. 基线特征对照组、LT50组和GT50组的平均年龄表1研究人群的基线特征和实验室数据TC（mmol·L-1）4.1 ± 0.8 4.5 ± 1.2 3.8 ± 1.0低密度脂蛋白胆固醇（mmol·L-1）2.3 ± 0.7 2.5 ± 0.9 1.9 ± 0.8c高密度脂蛋白胆固醇（mmol·L-1）1.3 ± 0.4 1.3 ± 0.3 1.2 ± 0.4TG（mmol·L-1）1.2 ± 0.8 1.8 ± 1.5 2.0 ± 1.7a载脂蛋白A1（g·L-1）1.5 ± 0.2 1.5 ± 0.3 1.5 ± 0.4载脂蛋白B（g·L-1）0.8 ± 0.2 0.8 ± 0.3 0.7 ± 0.2载脂蛋白E（mg·L-1）38.5 ± 13.0 40.5 ± 13.8 37.1 ± 18.5LP（a）（mg·L-1）367.6 ± 392.3264.9 ± 362.0312.2 ± 356.0血红蛋白（g·L-1）134.6 ± 19.0 135.7 ± 15.4 138.3 ± 12.4白蛋白（g·L-1）38.1 ± 2.2 39.2 ± 3.4 41.6 ± 5.8谷丙转氨酶（U·L-1）24.9 ± 26.9 24.9 ± 24.6 31.3 ± 21.2谷草转氨酶（U·L-1）65.6 ± 142.8 20.9 ± 7.5 28.3 ± 14.3分别为（61.4 ± 7.5）、（60.6 ± 10.8）和（61.7 ± 9.0）岁男性分别为68.4%、64.3%和84.4%（表1）。的GT50与LT 50组相比，LT 50组的低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）显著降低。甘油三酯（TG）水平是一个糖化血红蛋白（%）碱性磷酸酶（U·L-1）7.2 ± 2.4 5.9 ± 0.8 6.1 ± 0.657.4 ± 13.8 60.3 ± 19.6 65.8 ± 26.3动脉粥样硬化CVD的危险因素[29]，并且在本研究中观察到TG血浆水平升高伴动脉粥样硬化进展。糖尿病（DM）是CAD的风险因素[30]，其中DM定义为空腹血糖大于7.0 mmol L-1或有DM病史。在我们的队列中，我们观察到LT 50和GT 50组的DM发生率显著低于对照组，尽管三组之间的空腹血糖没有显著差异。GT50组高血压发生率明显低于对照组。我们没有看到三组之间的其他参数的显着差异。3.2. 肠道微生物群群落结构的丰富度（Chao1，Evenness）和多样性（Shannon，Simpson）估计值在这项研究中，使用Illumina高通量测序研究了粪便样品的细菌群落。在3%的相异性水平下，我们总共鉴定了164690个OTU，每个样品平均2111个（n= 78）OTU。OTU随CAD严重程度的增加呈下降趋势，但差异无统计学意义，属数在3组间差异无统计学意义，提示对照组的a多样性并不显著高于CAD患者。通过比较三组之间的Chao1指数、Shannon指数、Simpson指数和均匀度指数进一步证实了这一观察结果，这表明三种CAD表型之间的每个参数均无显著差异（附录A）。3.3. 肠道微生物组b多样性另一方面，使用Bray-Curtis相似性的多维标度图（MDS）基于b多样性确定样品间的肠道微生物组相似性表明，沿第一轴可见相对分离，占数据中维度分布的37.4%。使用PERMA-NOVA统计方法，CAD表型解释了约6.1%的变化微生物相似性（R2=0.061,p0.01，图1（a））。 系统聚类树状图（图1（b））显示相似性与其各自的CAD表型无关。胆红素（ng·mL-1）15.9 ± 17.4 10.4 ± 4.1 13.0 ± 8.7胆汁酸（mmol·L-1）4.6 ± 3.4 4.2 ± 2.2 4.1 ± 3.0尿素（mmol·L-1）6.5 ± 3.2 5.9 ± 3.0 4.9 ± 1.8eGFR（mL·min-1·（1.73m2）79.9 ± 15.1 84.1 ± 12.8 85.3 ± 15.8尿酸（mmol·L-1）314.6 ± 113.9380.7 ± 165.5326.3 ± 78.2葡萄糖（mmol·L-1）6.3（5.2Na+（mmol·L-1）141.7 ± 5.3 141.6 ± 3.2 141.7 ± 1.9K+（mmol·L-1）4.0 ± 0.5 4.1 ± 0.2 3.9 ± 0.6Cl-（mmol·L-1）100.9 ± 5.6 103.7 ± 3.9 103.0 ± 2.9ap0.05 vs对照组;bp 0.01 vs对照组;cp 0.05 vs LT 50组。体重指数：体重指数; DM：糖尿病; HBP：高血压; TC：总胆固醇; LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇; HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇; TG：甘油三酯; ApoA 1：载脂蛋白A-I;ApoB：载脂蛋白B; ApoE：载脂蛋白E; LP：脂蛋白; Hb：血红蛋白; ALT：丙氨酸氨基转移酶; AST：天冬氨酸氨基转移酶; eGFR：估计肾小球滤过率。数据表示为平均值±标准差（SD）或中位数（四分位数（IQR））。3.4. 肠道微生物群落结构使用进一步的层次聚类分析来比较78名患者之间肠道微生物组的相似性。多变量无监督PCA（图2（a））没有将三种CAD表型（即Ctrl、LT 50和GT 50）彼此分开。监督PLSDA（图2（b））显示了三种CAD表型之间的区别，Q2= 0.20，表明模型的预测能力非常低。然后我们比较了三组肠道菌群结构结果表明，95%以上的细菌种群可分为放线菌门、拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门4个类群，以及拟杆菌门、芽孢杆菌门和梭菌门等几个类群。与对照组相比，LT 50中厚壁菌门和Clos-tridia的相对丰度显著增加，变形菌门的相对丰度显著降低（p0.05）。共检测到233个属总共78个研究对象;根据所有三个组的平均相对丰度，从最大到最小的10个最丰富的属如图4（a）所示。基于人类远端肠道微生物群的三种不同肠型的发现[31，32]，我们评估了三个不同组是否具有不同的肠型谱。图4（b）显示肠型I和III的比例随着CAD发病而降低，而肠型II的比例随着CAD发病而增加。此外，肠型特征显示，变量Ctrl（n= 19）LT50（n= 14）GT50（n= 45）年龄（岁）61.4± 7.560.6± 10.861.7± 9.0性别（男性%）68.464.384.4BMI24.2± 4.323.4± 3.424.7± 2.4DM（%）47.414.3a15.6bHBP（%）78.957.144.4a白细胞（×109L-1）7.8± 3.86.1± 2.37.0± 2.5J. - L. 胡志F. 姚，M.-N. Tang等人工程7（2021）17151718Fig. 1. (a)通过CAD表型可视化的肠道微生物组的b多样性。显示了基于三种CAD表型之间的Bray-Curtis差异的MDS图PERMANOVAF = 2.42，R2= 0.061，p0.01。(b)的层次聚类树图采用Bray-Curtis相异度法对照组和GT 50组之间存在显著差异（p= 0.04，v2检验）。据报道，厚壁菌门与拟杆菌门的比例（F/B比）与代谢性疾病有关[33];然而，在我们的研究中，我们发现三组之间的F/B比没有显著差异。比值（中位数（四分位数（IQR））分别为0.49（0.37对照组、LT 50组和GT 50组分别为0.47（0.36我们进一步使用线性判别分析（LDA）的效果大小（LEfSe）的方法，以确定分类单位，可以区分不同的群体。在图5（a）中，总共20个细菌分类群在对照组、LT 50组和GT 50组中差异富集。在对照组的粪便样品中，富集了13个细菌分类群：拟杆菌科（Bacteroidaceae）（拟杆菌科及其属）; δ变形菌门（δ变形菌纲，脱硫弧菌目，脱硫弧菌科及其属）;梭杆菌门（Fusobacteria门，梭杆菌纲，梭杆菌目，梭杆菌科及其属）;放线菌属;和梭菌XIX.在LT50组中，富集的细菌是普雷沃氏菌科和四个属，副拟杆菌属、丁酸球菌属、狭义梭菌属和厌氧杆菌属。普雷沃氏菌科和拟杆菌属属于拟杆菌目，其余3属属于梭菌科.在GT 50组中，富集的细菌为两个属，Roseburia和Butyricimonas;前者属于厚壁菌门，后者属于拟杆菌门。上面列出了在图5（b）中。由于δ变形菌纲及其脱硫弧菌目与脱硫弧菌科具有相同的丰度，因此拟杆菌科与脱硫弧菌科具有相同的丰度。其拟杆菌属、梭杆菌门及其梭杆菌纲与梭杆菌目的丰度相同，图5（b）中省略了5个相对较高的分类水平。拟杆菌属的相对丰度 LT50组和GT50组的丁酸单胞菌和普雷沃氏菌科的丰度均显著高于对照组。LT 50和GT 50组中脱硫弧菌科、拟杆菌属、梭杆菌目、其梭杆菌科及其梭杆菌属的相对丰度显著低于对照组。GT50组中罗斯拜瑞氏菌属的相对丰度显著高于对照组。GT50组中丁酸球菌属的相对丰度显著低于LT50组。使用多变量logistic回归分析，我们测试了每个上述肠道微生物群分类的丰度及其与CAD表型的关联。如表2所示，梭杆菌门（门，其纲为梭杆菌属，图二. 人类粪便微生物群落判别的多元统计分析。(a)总队列的PCA二维（2D）评分图（R2= 0.88，Q2= 0.82）。（b）显示三种不同CAD表型之间的区分的监督PLSDA 2D评分图：狭窄50%（LT 50）、狭窄> 50%（GT 50）和无狭窄（Ctrl）（R2= 0.85，Q2= 0.20）。PC：主成分。J. - L. 胡志F. 姚，M.-N. Tang等人工程7（2021）17151719图3.第三章。在具有三种不同CAD表型的人类受试者中在（a）门和（b）类水平上的粪便微生物比较：狭窄50%（LT 50）、狭窄> 50%（GT 50）和无狭窄（Ctrl）。通过Wilcoxon秩和检验计算p值，仅标记小于0.05的p值见图4。粪便微生物属级比较和肠型组成。(a)具有三种不同CAD表型的人类受试者之间属水平的粪便微生物比较。只有10个最丰富的属的基础上，所有三个组的总和显示。通过Wilcoxon秩和检验计算p值，仅标记小于0.05的值（b）三种CAD表型之间的肠型组成的比较：狭窄50%（LT 50）、狭窄> 50%（GT 50）和无狭窄（Ctrl）。通过v2检验计算p梭杆菌目、梭杆菌科和梭杆菌属）和嗜胆汁菌与动脉粥样硬化发生的相似性降低相关;例如，粪便梭杆菌丰度高于中位数范围的人类受试者仅19%（95%CI：4.1%和26%（95% CI：8.1%在调整了脆性风险因素（年龄、性别、HBP、高密度脂蛋白（HDL）、LDL和糖尿病）和肾功能（CAD风险的传统因素）后[34，35]，相关性仍然存在，除了梭杆菌科及其属梭杆菌与LT50的相关性，这表明梭杆菌及其亚分类群的丰度增加与CAD风险降低独立相关。分类群δ变形菌和梭菌XIX的相对丰度增加与CAD的不存在显著相关（即，GT50），即使在调整了脆性风险因素和肾功能后，但与LT50的缺乏无显著相关，因为LT50组的参与者处于早期进展阶段，CAD，提示两个分类群在降低动脉粥样硬化风险中的作用。另一方面，增加的普雷沃氏菌科或副拟杆菌属丰度与发展LT50或GT50的可能性增加独立相关，表明这两个分类群可能是促动脉粥样硬化的。相比之下，梭菌、三角变形菌、嗜胆菌和梭菌XIX可以是抗动脉粥样硬化的，并且可以起到益生菌的作用。为了进一步研究由LEfSe鉴定的20个分类群组成的细菌标志物对不同CAD表型的预测价值 图图6（a）示出了LT 50相对于对照的AUC为1.00，并且在Hosmer-Lemeshow拟合优度检验（v2= 0，自由度（df）=7）中p值为1.00，这表明组合的20种微生物分类群特征可以完 美地区分LT 50 和对照 。图 6 （ b ） 显示 AUC 为 0.97（95%CI：J. - L. 胡志F. 姚，M.-N. Tang等人工程7（2021）17151720图五.具有三种不同CAD表型的人类参与者的微生物群落组成特征。(a)LEfSe鉴定了在不同CAD表型中富集的粪便微生物分类群，LT 50和GT 50与对照相比（通过Kruskal-Wallis检验，p(b)已鉴定微生物分类群的相对丰度：狭窄50%（LT 50）、狭窄> 50%（GT 50）和无狭窄（Ctrl）。根据Mann-Whitney U检验，*p 0.05、**p 0.01和*p0.001具有显著差异0.92- 图 6 （ c ） 显 示 了 LT 50 + GT 50 相 对 于 对 照 的 AUC 为 0.95（95%CI：0.89-图6（d）显示了GT 50相对于Ctrl + LT 50的AUC为0.88（95%CI：0.80-通过选择ROC曲线的Youden指数的最大值，我们发现，对于组合的20种微生物分类群，分别区分LT 50 vs Ctrl、GT 50vs Ctrl、LT 50 + GT 50 vs Ctrl和GT 50 vs Ctrl + LT 50的预测准确度分别为100%、95.3%、88.4%和87.2%。3.5. 验证先前发现的CAD先前报道在CAD患者中存在丰富的几个分类群。Jie等[36]比较了218个对187名健康对照者和187名动脉粥样硬化性心血管疾病（ACVD）患者的血清学进行了检测，发现ACVD中富含肠杆菌科和链球菌属。我们的数据不支持肠杆菌科或链球菌属的富集。在CAD中，显示肠杆菌科的丰度（中位数（IQR））为0.039（0.0230.105），以及的链球菌 spp.0.0024（0.00160.0032（0.0016LT 50组和GT 50组。根据Wilcoxon秩和检验，不同组显示无显著性差异。Jie等人[36]还报道了拟杆菌属（Bacteroidesspp.）结果表明，ACVD患者的类杆菌相对丰度降低，这与我们的研究结果一致，即类杆菌属在LT50中的相对丰度（中位数（IQR）：0.21(0.13–0.36)) andGT50 (median (IQR):(0.16-0.34））显著低于对照组（中位数（IQR）：0.36（0.17Yin等人[37]比较了大动脉粥样硬化性卒中或短暂性脑缺血发作（TIA）患者与健康对照之间的粪便微生物群差异，还发现卒中/TIA患者的拟杆菌丰度因此，拟杆菌似乎可以预防CVD。据报道，罗斯拜瑞氏菌随着动脉粥样硬化症状的增加而减少[38]，无菌载脂蛋白E（ApoE）缺失小鼠中罗斯拜瑞氏菌的定植可以调节J. - L. 胡志F. 姚，M.-N. Tang等人工程7（2021）17151721×××Bb表2根据肠道微生物群丰度的冠状动脉粥样硬化表型的比值比（95% CI）分类模型表型控制LT50 GT50拟杆菌科/拟杆菌A 1.00 0.35（0.08B 1.00 0.36（0.05三角形变形菌A 1.00 0.27（0.06B 1.00 9.50× 10-4（2.40× 10-7脱硫弧菌科/脱硫弧菌目A 1.00 0.27（0.06B1.009.5010 - 4（2.4010-7梭杆菌门/梭杆菌亚门/梭杆菌目A 1.00 0.19（0.04-0.84）a 0.26（0.08-0.80）aB 1.00 0.02（5.1010-4梭杆菌科A 1.00 0.13（0.03B 1.00 2.00× 10-7（1.00× 10-7梭杆菌A 1.00 0.08（0.01 - 0.46）0.21（0.07 - 0.66）B 1.00 1.40× 10-7（1.00× 10-7双花属一1.000.20（0.040.18（0.05B 1.00 1.70× 10- 3（5.20× 10- 5放线菌一1.002.29（0.560.43（0.13B1.000.95（0.100.35（0.07梭菌十九一1.000.23（0.040.21（0.06B1.000.23（0.020.14（0.02普雷沃苔科一1.005.08（1.085.63（1.61B1.00（1.41（4.70Parabacteroides一1.007.00（1.493.20（0.99B1.0022.65（1.3711.2（1.45Butyricicoccus一1.004.07（0.850.81（0.28B1.00（1.215.79（0.90狭义梭菌一1.007.94（1.602.07（0.67B1.00483.60（0.462.66（0.44阿纳埃里一1.007.00（1.493.20（0.99B1.009.57（0.846.51（1.03罗斯拜瑞一1.001.63（0.393.25（1.04B1.002.07（0.203.40（0.65丁酸菌属一1.002.81（0.616.80（1.93B1.000.93（0.104.91（0.90比较了高于中位值与低于中位值的每种细菌分类群预测动脉粥样硬化表型的比值比（95%CI）。A：未校正; B：校正了脆性风险因素（年龄、性别、HBP、HDL、LDL和糖尿病）和肾功能。ap0.05;bp 0.01。盲肠丁酸积累，降低全身炎症，并改善动脉粥样硬化[39]。然而，在我们的研究中，我们注意到粪便罗斯拜瑞氏菌丰度在GT 50、CAD组中显著高于对照组，并且其显示出随着动脉粥样硬化进展而增加的趋势（ANOVA，p= 0.002）。对照组、LT 50组和GT 50组的丰度（平均值±标准差（SD））分别为0.014 ± 0.003、0.022 ± 0.004、0.022 ±0.005。0.028 ± 0.004。4. 讨论饮食习惯是肠道菌群（也称为肠型）的重要决定因素[40]。肠型II在素食受试者中富集[41]。在我们的研究中，我们发现肠型II在CAD中富集，这与Emoto等人的早期报告相反。[10]。素食对健康有益[41]。CAD患者肠型II增加可能是由于根据患者的知识进行积极的饮食调节。事实上，De Filippis等人[42]报告称，寡型普雷沃氏菌显示出素食者和杂食者之间的区别，并且发现杂食饮食相关寡型与TMAO的循环水平呈正相关[43]，TMAO是动脉粥样硬化CVD和血栓形成的促动脉粥样硬化代谢物[44，45]。Emoto等人[10]报告称，肠型II随着CAD发病机制而减少，这可能是由于素食相关的寡型普雷沃氏菌减少我们发现CAD患者肠型II增加可能是由于素食相关寡型增加肠型II和CAD风险之间的关系的进一步证明应集中在普氏菌寡型组成或菌株水平。CAD是一种慢性炎症性疾病，肠道微生物群已成为一种新的治疗靶点，通过产生生物活性代谢物（如SCFA、原儿茶酸、胆汁酸和肠内酯）来减少炎症过程[16，46]。不同的微生物群对炎症表现出不同的影响，包括促炎症、抗炎症或无炎症，因此肠道微生物群与ACVD之间的关联已成为一个热门话题。到目前为止，关于肠道微生物群丰度与CVD之间的关联的论文数量非常有限。在一篇论文中，据报道，与对照组相比，CAD患者中乳杆菌目显著增加，拟杆菌门减少[10]。在我们的研究中，我们使用LefSe-Galaxy并确定了20种与CAD患病率相关的细菌分类群。此外，我们使用多变量逻辑回归，并证实了分类单元梭杆菌门/梭杆菌亚门/梭杆菌目/梭杆菌科/梭杆菌属、Biolophila和梭菌XIX的丰度与CAD风险呈负相关，而Prevotellaceae和Parabacteroides的丰度与CAD风险呈正相关。我们还发现，这里提到的九个分类群可以独立预测CAD风险。我们没有发现冠心病患者和对照组之间的乳酸杆菌的顺序有任何显着差异。我们确实观察到CAD患者的拟杆菌科及其属减少。使用多变量逻辑回归，我们注意到，仅在校正果糖危险因素和肾功能后，拟杆菌科及其属的增加与GT50的冠状动脉患者减少相关（表2）。乳酸杆菌目被认为是益生菌，因为它可以发酵食物产生乳酸[47]。因此，先前关于CAD中乳酸杆菌目增加的报道一J. - L. 胡志F. 姚，M.-N. Tang等人工程7（2021）17151722见图6。使用Hosmer-Lemeshow拟合优度检验的CAD预测概率的二元逻辑回归模型的ROC曲线。包含通过LEfSe鉴定的20个分类群的细菌特征的组合对于所有横截面比较实现高于0.88的AUC（a）LT 50与对照组;（b）GT 50与对照组;(c)LT 50 + GT 50对比对照;（d）GT 50对比对照+LT 50。患者在本研究中不可重现，这是可以预期的。拟杆菌属物种可以将未消化的多糖发酵成小分子，例如生物活性SCFA[48]。SCFA具有抗炎特性，有助于维持心血管健康[49]。乙酸和丙酸可通过嗅觉受体78（OLFR 78）调节血压[50，51]。之前的报告也提到，动脉粥样硬化性卒中或TIA患者的拟杆菌丰度降低[37]。因此，减少拟杆菌丰度可能是CAD的可靠指标。具核梭杆菌诱导粘蛋白分泌和肿瘤坏死因子（TNF）-α表达，导致肠道疾病，如炎症性肠病（IBD）[52]。另一方面，梭杆菌及其亚类群似乎是抗动脉粥样硬化的。据报道，梭杆菌属的一个种，具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum），是一种在牙周病中普遍存在的革兰氏阴性厌氧菌，通过调节宿主免疫应答和动脉粥样硬化风险因子，对ApoE缺失小鼠具有动脉粥样硬化保护作用[53，54]。梭菌是否导致致病或具有有益作用取决于与其相互作用的细菌群落[54]。Bilophila和Clostridium XIX也显示CAD风险降低。Bilophila是脱硫弧菌科的一个属，随着动物饮食而增加[55]。某些种类的嗜胆汁菌可还原亚硫酸盐产生H2S，导致T细胞活化和肠道通透性增加[56，57]，预计这会增加CAD的可能性。因此，CAD患者中Bilophila丰度的降低可能是由于饮食习惯的调整，而不应用作测定CAD风险的可靠标志物。一个研究小组比较了重度抑郁症患者和健康对照之间的肠道微生物群结构，并报告称梭菌XIX是发现患者中比健康对照中更高的属之一[58]。因此，CAD导致梭菌XIX丰度降低需要进一步确认。Prevotellaceae和Parabacteroides是与CAD风险正相关的两个分类群。在肠道中，普雷沃氏菌科可以富含膳食碳水化合物，并负责多糖分解[59普雷沃氏菌科产生琥珀酸，其在高血压、缺血性心脏病和2型糖尿病中增加，并且被认为是由肠道微生物组驱动的CVD风险的代谢物特征[61，62]。据报道，在饮食中添加益生菌乳酸菌后，普雷沃氏菌增加[63]。在尿毒症大鼠中，发现乳杆菌科和普雷沃氏菌科均减少[64]，表明两个分类群之间呈正相关。帕金森病患者Jeffery等人[66]的一份独立报告指出，肠道中高丰度的普雷沃氏菌科与发展免疫介导的脑疾病的风险降低有关，这表明该分类群具有一些有益的作用。用酒精喂养后，小鼠肠道中的副巴茨类化合物增加[67]。据报道，副拟杆菌属的一个物种Parabacteroidesgoldsteinii是一种抗炎细菌，在喂食胆碱缺乏氨基酸（CDAA）定义的饮食的小鼠中减少，从而发展脂肪性肝炎[68]。一个研究小组比较了多发性硬化症患者和健康对照者之间的肠道微生物群结构 ， 并 报 告 说 健 康 对 照 者 中 的 副 拟 杆 菌 更 高 。 因 此 ， 似 乎Parabacteroides 应 被 视 为 益 生 菌 [69] 。 越 橘 可 以 增 加 盲 肠 中Parabacteroides的相对丰度[70]。此外，副拟杆菌与SCFA的产生有关。果胶可以增加该类群的丰度[71]，因此LT50中富集的副拟杆菌可能是CVD患者饮食转换的效果，这将有助于减毒动脉粥样硬化的进展。因此，副拟杆菌可能不是导致CAD的原因。严格意义上的梭状芽孢杆菌显示出丰度随着CAD发病机制。梭菌属中的许多物种可以J. - L. 胡志F. 姚，M.-N. Tang等人工程7（2021）17151723利用胆碱产生三甲胺，其有助于产生促动脉粥样硬化剂TMAO。因此，富集的梭菌属将导致ACVD。然而，经过逻辑回归分析，这一分类群的人口增加，只有显着相关的LT50的频率增加，而不是与GT50。此外，在校正脆性风险因素和肾功能后，该分类群丰度与LT50频率之间的显著相关性消失（表2）。这一发现表明，多种因素调节这一分类群的丰度。然而，我们可以说，严格意义上的梭菌可能参与调节动脉粥样硬化CVD相关的多种因素。LT_（50）是动脉粥样硬化发展的早期阶段，而GT_（50）是动脉粥样硬化发展的进一步进展阶段。与对照组相比，上述大多数类群显示出几乎相同的趋势变化，表明CAD相关的肠道微生物群可能稳定地限于几个类群。确定的肠道微生物群分类群与CAD之间的关联是原因还是结果需要进一步阐明。通常，肠道中益生菌群落的减少是导致疾病的原因然而，存在一些与CAD相关的非预期结果，例如先前报告的CAD患者中乳酸杆菌增加[10]，以及目前报告的普雷沃氏菌和副杆菌增加。肠道微生物群与CAD的关联是一个有趣而重要的领域，值得进一步研究。根据我们的数据和先前发表的数据[12]，只有减少类胡萝卜素是CAD发病机制的可靠指标。因此，通过优化饮食组成来增加拟杆菌的丰度来治疗心脏病可能成为一种有前景的治疗方法。5. 结论肠道微生物群与CAD进展有关，可用于诊断CAD患病率。然而，与CAD相关的微生物分类群在不同的队列中并不总是可重复的，只有减少的拟杆菌是CAD患病率的可靠指标。致谢这项研究得到了上海市徐汇区科学技术委员会人工智能项目2（胡佳璐）、上海市公共卫生人