多组学分析揭示了肠道微生物对医疗卫生的重要性

工程研究

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工程

（

2022

）

115

研究

医疗卫生-文章

多组学分析提供了基于肠道微生物群

裴汉

，

，李丽莎

，

，王子喜

，

，林希

，

，于航

，林聪

，张正伟

，付

杰

，彭冉

，潘立斌

，马树荣

，王雪艳

，王洪田

，王向东

，

王燕

，

孙金吕

，

姜建东

，孙

金吕

中国医学科学院北京协和医学院药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验室，北京

100050

中国医学科学院北京协和医院过敏性疾病诊治精准医学北京市重点实验室国家免疫与皮肤病临床研究中心变态反应科，中国

耳鼻咽喉头颈外科过敏科耳鼻咽喉头颈外科教育部重点实验室

首都医科大学附属北京同仁医院，北京

100005

首都医科大学附属北京世纪坛医院变态反应科，北京

100038

首都医科大学附属北京同仁医院北京耳鼻喉科研究所北京市重点实验室，北京

100005

阿提奇莱因福奥

文章历史记录：

2020年12月27日收到

2021

年

月

日修订

2021年3月29日接受

2021年5月1日网上发售

关键词：

代谢组

肠道菌群干草热

过敏性疾病

肠屏障功能障碍

A B S T R A C T

由于变态反应性疾病在世界范围内流行，而且还没有治愈的方法，因此迫切需要探索其病理生理机制。由于过

敏性疾病与肠道生态失调有关，我们从宿主和微生物群之间的分子界面的角度，同时进行代谢组学和微生物群

组成分析，寻找可能的机制。给Sprague-Dawley大鼠注射

蒿属

花粉提取物以刺激对花粉的过度反应。这种过

度反应减少了缬氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、吲哚丙酸酯（IPA）和肌醇的循环，并减少

了粪便中的短链脂肪酸（SCFA）。几个有益的属属于瘤胃球菌科，毛螺菌科，梭菌下降模型组，而

螺杆菌

和

阿克曼氏菌

只在模型组中表达。模型组大鼠小肠claudin-3和肝脏脂肪酸结合蛋白表达下调，并与代谢改变和细

菌相关

。

我们的研究结果表明，氨基酸及其衍生物（特别是缬氨酸和IPA，这是色氨酸的还原产物），SCFA

和肠道微生物组（特别

是阿克曼氏菌

和

螺杆菌

）的改变可能会通过抑制claudin蛋白的表达和影响粘液层来破坏

肠道屏障功能，这进一步导致花粉热。

BY-NC-ND许可下的开放获取文章

（

http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/

）中找到。

介绍

花粉热是一种季节性过敏性鼻炎（AR），主要影响上呼吸系统。它

是由吸入植物花粉引起的，只发生在特定的个体群体中[1]。对风媒花粉

和虫媒花粉的过敏反应均有报道，症状各不相同。

通讯作者。

电子邮件地址：

entwxd@vip.sina.com

（

X.- D. Wang

），

wangyan@imm.ac.cn

（

Y.Wang

），

sunjinlv@pumch.cn

（

J.- L. Sun

），

jiang. 163.com

（

J.- D. Jiang

）。

这些作者对这项工作做出了同样的

疾病的严重程度取决于个人的具体健康状况[2，3]。迄今为止，全世界

已确认有150多种花粉过敏原来源于草、杂草和树木[4]。在北美和欧

洲，主要致敏花粉分别来自

豚草属

和禾本科。在中国，特别是在北方，

蒿属

和

葎草

属花粉是秋季花粉热的主要贡献者[5，6]。

花粉热病理学的主流学说主要集中在不平衡的免疫系统。

Wambre

等人

[7]

首先发现了

型辅助性

细胞的一个亚群，命名为

，这是与过敏性疾病发病机制有关的特异性细胞尽管对过敏性疾

病免疫成分的研究

https://doi.org/10.1016/j.eng.2021.03.013

由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇基于

CC BY-NC-ND

许可证的开放获取文章

（

http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/

）。

可在ScienceDirect上获得目录列表

工程

杂志首页：

www.elsevier.com/locate/eng

P. Han

，

L.- S.

李志

X. Wang

等人

工程

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尽管已经进行了二十多年，但仍然没有有效的策略来扭转这种过敏流行

[8，9]。研究人员已经开始意识到过敏症可能不仅仅是免疫系统紊乱。

这是因为全基因组关联分析允许鉴定数十个与花粉热相关的基因座

[10，11]。然而，异常基因并不一定导致表型改变，从而降低其预测疾

病的能力。其他研究表明，肺上皮缺损与花粉热风险相关[9]。然而，迄

今为止，还没有一个全面的理论可以解释花粉热的病理过程。因此，

疾病发病机制的研究可能有助于改善疾病监测和新的药物治疗策略

[12，13]。

哺乳动物体内有

万亿这种复杂的菌群拥有数百倍于人类基因组

中编码的基因，导致广泛的代谢活动

[15]

。然而，确定宿主相关肠道

微生物群的功能状态是具有挑战性的，因为细菌数量巨大，对宿主

微生物群相互作用的理解相对较差组学技术的出现，特别是代谢组

学，为肠道细菌功能的研究开辟了新的场景

[17]

。代谢组学是在给定

条件下分析生命系统中完整的低分子量代谢物，即代谢组

[18]

。从本

质上讲，代谢组实时代表了整体生理状态，反映了基因组修饰和环境

刺激对生命系统的相互作用

[19]

。

肠道微生物群生态失调与免疫介导的疾病（例如过敏性疾病）的

病原体形成有关例如，与牛奶过敏持续存在的儿童相比，牛奶过敏已

消退的儿童显示

出梭菌

和厚壁菌门的富集

[17]

。在这项初步研究中，

我们在大鼠模型中结合了非靶向代谢组学分析和微生物群多样性分

析，以更好地定义与花粉症相关的内部变化本研究旨在鉴定与花粉热

相关的代谢物和肠道细菌，并深入了解花粉热的潜在病理生理机制。

材料和方法

2.1.

化学试剂

高效液相色谱（ HPLC ）级乙腈和甲醇购自 Thermo Fisher

Scientific Co.，有限公司（中国）。超纯水得自杭州娃哈哈集团有限公

司，（中国）。色谱级丙酮购自国药化学试剂有限公司，有限公司（中

国）。含有1%三甲基氯硅烷

的

，

O-双（三甲基甲硅烷基）三氟乙酰

胺、O-甲氧基胺-盐酸、琥珀酸-

酸、丙酸和丁酸（99.9%）购自Sigma-

Aldrich（USA）。乙酸（100%）购自Merck（Germany）。氯化钠、

碳酸氢钠和Al（OH）

获自Solarbio

Life

科学（中国）。苯酚购自Aladdin

（中国）。

2.2.

动物实验

雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（体重约200 g）购自中国医学科

学院（中国）实验动物研究所。将动物圈养在具有12小时定期明暗循环

的受控房间中所有程序均获得动物

中国医学科学院和北京协和医学院实验动物研究所伦理委员会，并按照

机构指南和伦理进行。

将蒿

属植物花粉溶解于Coca然后将花粉提取物与Al（OH）

以1：1

（ v/v ）的比例混合。将大鼠随机分为对照

组

和模型组，每组 8 只

（n= 8）组。适应6天后，在第7、13和19天通过腹膜内（i.p.）注射。

致敏后，从第20天至第25天，动物接受20μ L（每毫升10μ L）生理盐

水或花粉提取物在实验结束时收集血浆、尿液、粪便和肠实验的设计如

图所示。 1（a）.

2.3.

模型评估

花粉特异性免疫球蛋白E（IgE）的水平采用酶联免疫吸附试验

（ELISA）进行测定。当使用ELISA试剂盒时，严格遵循制造商的方案

（BioTSZ，USA）。鼻腔组织标本用4%多聚甲醛溶液固定，然后用乙

二胺四乙酸（EDTA）溶液浸泡脱钙2周，其间更换新鲜溶液。HE-伊红

染色。

2.4.

代谢组学分析

将血浆、尿液、粪便和肠样品立即储存在

80°C

下直至分析。对于

血浆和粪便代谢组学分析，使用与

GCMS-QP 2020

单四重质谱仪偶

联的

Shimadzu

（

Japan

）

GC-2010 Plus

气相色谱系统。样品处理和

气相色谱

质谱（

GC-MS

）分析均

2.5.

肠屏障功能标志物的测量

使用ELISA（尿密蛋白-3（cat.KL-CLDN 3-Ra;上海康朗生物科技

有限公司，有限公司、中国）; L-FABP（目录号ARB 12324; Beijing

BioRab Technology Co. ，有限公司、中国） ; 和 I-FABP

（cat.ARB14534; Beijing BioRab Technology Co.，Ltd.））。

2.6.

实时定量聚合酶链反应评估

claudin-3

和

L-FABP

的表达

采用实时定量聚合酶链反应（

RT-qPCR

）检测肠组织中

claudin-

和

L-FABP

的表达。用

NucleoZOL

试剂（

Machery-Nagel

，德国）

以每

100 mg

组织的比率分离总

RNA

。

ImL NucleoZOL

，并使用

QuantScript RT

试剂盒（

TIANGEN

，中国）进行逆转录成互补

DNA

（

cDNA

）。将所得

cDNA

用作模板。

RT-qPCR

引物来自已发

表的参考文献，如表

所示

[20

，

21]

。甘油醛

-3-

磷酸脱氢酶

（

GAPDH

）用作内部参考。使用

ABI 7500

实时聚合酶链反应

（

PCR

）系统（

Applied Biosystems

，

USA

）进行

RT-qPCR

反应条

件如下：在

95°C

下预变性

秒，

然后进行40个循环的熔融（95°C， 10 s）和退火。

延伸（60°C持续30秒）。每个模板的PCR反应是

P. Han

，

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李志

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等人

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图

一、动物模型的建立和评价。（

）研究的实验设计

;

（

）血清特异性免疫球蛋白

（

IgE

）水平

;

（

）鼻粘膜中粒细胞的密度数据表示每组

只大鼠的平均值

标准差（

）

0.001

，使用

表1

本研究中使用的引物序列

引物名称引物序列（

紧密连接蛋白

-3

（正向）

CATCCTGCTGGCCGCCTTCG

Claudin-3

（反向）

CCTGATGATGGTGTTGGCCGAC

L-FABP

（正向）

CCTCATTGCCCATATGAACTTCTCCGG

L-FABP

（反向）

AGCGGATCCTAAATTCTTGCTGACTC

GAPDH（正向）GCCACATCGCTCAGACACCA

GAPDH（反向）CTCAGCCTTGACGGTGCCAT

在

孔板中一式三份进行采用循环阈值（

）值比较模型组和对照

组的基因表达水平

2.7.

微生物多样性分析

使用E.Z.N. A.

土壤DNA试剂盒（Omega Bio-tek，USA）根据制

造商用引物338 F（5 0 - ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3 0）和80 6

R（5 0 -GGACTACHVG）扩增细菌16 S核糖体RNA（rRNA）基因的

V3-

GGTWTCTAAT-3

）。然后从2%琼脂糖凝胶中提取PCR产物，并使用

AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒（Axygen Biosciences，USA）纯化。

然后对纯化的扩增子进行Illumina MiSeq测序分析。

2.8.

粪便样品中短链脂肪酸的靶向分析

该程序改编自先前发表的方案

[22]

。将所选短链脂肪酸（

SCFA

）

的储备溶液溶解在丙酮中，乙酸的浓度为

g mL

-1

，丙酸和丁酸

的浓度为

g mL

-1

校准曲线（浓度为

、

100

、

250

、

500

、

1000

、

2500

、

25000

、

250000

、

5000

、

12 500

、

25 000

和

50 000 ng mL

-1

; 2

、

20、40、100、200、500、1000和2000 ng mL

-1

），

用于SCFA的定量。

将每份粪便样品称重，并在室温（20-25 °C）下在8倍（g mL

-1

）丙酮

中浸泡3 h。在2450转离心之前，将样品涡旋直至混合物均匀

在

4 °C

下以每分钟（

rpm

）的速度搅拌

分钟。收集上清液用于气相

色谱（

）分析。气相色谱仪（

GC- 2014; Shimadzu

Cooperation

）用于分离

SCFA

，参数从文献中获得

[22]

。

2.9.

统计分析

在R Studio中的“XCMS”软件包内处理获得的GC-MS数据（峰拾取

和比对）。在R中分别归一化后，质量控制（QC）样品中相对标准偏差

30%且存在于70%样品中的特征被包括用于随后的多变量分析。在对数

转换和帕累托标度之后，对数据进行正交偏最小二乘判别分析（OPLS-

DA）。然后，根据协方差P[1]和相关性P

corr

值（P[1] > 0.05， P

corr

0.8，或P[1] 0.05，P

corr

0.6），应用源自该OPLS-DA模型的S图选择特

征。所有多变量分析均使用SIMCA版本14（MKS Umetrics AB，瑞

典）进行[23]。在原始数据中对所选的最差异表达特征进行半定量。特

征水平表示为峰面积与内标物峰面积的比值。通过比较检测到的代谢物

的裂解模式与美国国家标准与技术研究所（NIST）的光谱进行鉴别。

为了比较对照组和模型组，使用单变量非参数Mann-Whitney检验（双

侧）检查代谢特征或鉴定的细菌菌株的水平。

研究每种代谢产物与细菌

菌株与花粉热生物学变量，斯皮尔曼使用免费在线

Majorbio

云平台

（

Shanghai Majorbio Bio- Pharm Technology Co.

，有限公司、中

国）。

结果

3.1.

大鼠花粉热的特征

在激发阶段（从第

天至第

天），在模型中观察到显著的花粉

抗原诱导的鼻部症状

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cpongm

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