多组学分析揭示了肠道微生物对医疗卫生的重要性

工程15（2022）115研究医疗卫生-文章多组学分析提供了基于肠道微生物群裴汉a，#，李丽莎b，#，王子喜b，#，林希c，#，于航a，林聪a，张正伟a，付杰a，彭冉a，潘立斌a，马树荣a，王雪艳d，王洪田d，王向东e，王燕a，孙金吕b，姜建东a，孙金吕a中国医学科学院北京协和医学院药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验室，北京100050b中国医学科学院北京协和医院过敏性疾病诊治精准医学北京市重点实验室国家免疫与皮肤病临床研究中心变态反应科，中国c耳鼻咽喉头颈外科过敏科耳鼻咽喉头颈外科教育部重点实验室首都医科大学附属北京同仁医院，北京100005d首都医科大学附属北京世纪坛医院变态反应科，北京100038e首都医科大学附属北京同仁医院北京耳鼻喉科研究所北京市重点实验室，北京100005阿提奇莱因福奥文章历史记录：2020年12月27日收到2021年2月24日修订2021年3月29日接受2021年5月1日网上发售关键词：代谢组肠道菌群干草热过敏性疾病肠屏障功能障碍A B S T R A C T由于变态反应性疾病在世界范围内流行，而且还没有治愈的方法，因此迫切需要探索其病理生理机制。由于过敏性疾病与肠道生态失调有关，我们从宿主和微生物群之间的分子界面的角度，同时进行代谢组学和微生物群组成分析，寻找可能的机制。给Sprague-Dawley大鼠注射蒿属花粉提取物以刺激对花粉的过度反应。这种过度反应减少了缬氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、吲哚丙酸酯（IPA）和肌醇的循环，并减少了粪便中的短链脂肪酸（SCFA）。几个有益的属属于瘤胃球菌科，毛螺菌科，梭菌下降模型组，而螺杆菌和阿克曼氏菌只在模型组中表达。模型组大鼠小肠claudin-3和肝脏脂肪酸结合蛋白表达下调，并与代谢改变和细菌相关。我们的研究结果表明，氨基酸及其衍生物（特别是缬氨酸和IPA，这是色氨酸的还原产物），SCFA和肠道微生物组（特别是阿克曼氏菌和螺杆菌）的改变可能会通过抑制claudin蛋白的表达和影响粘液层来破坏肠道屏障功能，这进一步导致花粉热。©2021 THE COUNTORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇CCBY-NC-ND许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）中找到。1. 介绍花粉热是一种季节性过敏性鼻炎（AR），主要影响上呼吸系统。它是由吸入植物花粉引起的，只发生在特定的个体群体中[1]。对风媒花粉和虫媒花粉的过敏反应均有报道，症状各不相同。*通讯作者。电 子 邮 件地 址 ：entwxd@vip.sina.com（ X.- D.Wang ） ，wangyan@imm.ac.cn（Y.Wang），sunjinlv@pumch.cn（J.- L. Sun），jiang. 163.com（J.- D. Jiang）。#这些作者对这项工作做出了同样的疾病的严重程度取决于个人的具体健康状况[2，3]。迄今为止，全世界已确认有150多种花粉过敏原来源于草、杂草和树木[4]。在北美和欧洲，主要致敏花粉分别来自豚草属和禾本科。在中国，特别是在北方，蒿属和葎草属花粉是秋季花粉热的主要贡献者[5，6]。花粉 热病理 学的 主流学 说主要 集中在 不平 衡的免 疫系统 。Wambre等人[7]首先发现了2型辅助性T细胞的一个亚群，命名为TH2A，这是与过敏性疾病发病机制有关的特异性细胞尽管对过敏性疾病免疫成分的研究https://doi.org/10.1016/j.eng.2021.03.0132095-8099/©2021 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表工程杂志首页：www.elsevier.com/locate/engP. Han，L.- S.李志X. Wang等人工程15（2022）115116-尽管已经进行了二十多年，但仍然没有有效的策略来扭转这种过敏流行[8，9]。研究人员已经开始意识到过敏症可能不仅仅是免疫系统紊乱。这是因为全基因组关联分析允许鉴定数十个与花粉热相关的基因座[10，11]。然而，异常基因并不一定导致表型改变，从而降低其预测疾病的能力。其他研究表明，肺上皮缺损与花粉热风险相关[9]。然而，迄今为止，还没有一个全面的理论可以解释花粉热的病理过程。因此，疾病发病机制的研究可能有助于改善疾病监测和新的药物治疗策略[12，13]。哺乳动物体内有10万亿这种复杂的菌群拥有数百倍于人类基因组中编码的基因，导致广泛的代谢活动[15]。然而，确定宿主相关肠道微生物群的功能状态是具有挑战性的，因为细菌数量巨大，对宿主-微生物群相互作用的理解相对较差组学技术的出现，特别是代谢组学，为肠道细菌功能的研究开辟了新的场景[17]。代谢组学是在给定条件下分析生命系统中完整的低分子量代谢物，即代谢组[18]。从本质上讲，代谢组实时代表了整体生理状态，反映了基因组修饰和环境刺激对生命系统的相互作用[19]。肠道微生物群生态失调与免疫介导的疾病（例如过敏性疾病）的病原体形成有关例如，与牛奶过敏持续存在的儿童相比，牛奶过敏已消退的儿童显示出梭菌和厚壁菌门的富集[17]。在这项初步研究中，我们在大鼠模型中结合了非靶向代谢组学分析和微生物群多样性分析，以更好地定义与花粉症相关的内部变化本研究旨在鉴定与花粉热相关的代谢物和肠道细菌，并深入了解花粉热的潜在病理生理机制。2. 材料和方法2.1. 化学试剂高 效 液 相 色 谱 （ HPLC ） 级 乙 腈 和 甲 醇 购 自 Thermo FisherScientific Co.，有限公司（中国）。超纯水得自杭州娃哈哈集团有限公司，（中国）。色谱级丙酮购自国药化学试剂有限公司，有限公司（中国）。含有1%三甲基氯硅烷的N，O-双（三甲基甲硅烷基）三氟乙酰胺、O-甲氧基胺-盐酸、琥珀酸-d4酸、丙酸和丁酸（99.9%）购自Sigma-Aldrich（USA）。乙酸（100%）购自Merck（Germany）。氯化钠、碳酸氢钠和Al（OH）3获自Solarbio® Life科学（中国）。苯酚购自Aladdin®（中国）。2.2. 动物实验雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（体重约200 g）购自中国医学科学院（中国）实验动物研究所。将动物圈养在具有12小时定期明暗循环的受控房间中所有程序均获得动物中国医学科学院和北京协和医学院实验动物研究所伦理委员会，并按照机构指南和伦理进行。将蒿属植物花粉溶解于Coca然后将花粉提取物与Al（OH）3以1：1（v/v）的比例混合。将大鼠随机分为对照组和模型组，每组8只（n= 8）组。适应6天后，在第7、13和19天通过腹膜内（i.p.）注射。致敏后，从第20天至第25天，动物接受20μ L（每毫升10μ L）生理盐水或花粉提取物在实验结束时收集血浆、尿液、粪便和肠实验的设计如图所示。 1（a）.2.3. 模型评估花粉特异性免疫球蛋白E（IgE）的水平采用酶联免疫吸附试验（ELISA）进行测定。当使用ELISA试剂盒时，严格遵循制造商的方案（BioTSZ，USA）。鼻腔组织标本用4%多聚甲醛溶液固定，然后用乙二胺四乙酸（EDTA）溶液浸泡脱钙2周，其间更换新鲜溶液。HE-伊红染色。2.4. 代谢组学分析将血浆、尿液、粪便和肠样品立即储存在80°C下直至分析。对于血浆和粪便代谢组学分析，使用与GCMS-QP 2020单四重质谱仪偶联的Shimadzu（Japan）GC-2010 Plus气相色谱系统。样品处理和气相色谱-质谱（GC-MS）分析均2.5. 肠屏障功能标志物的测量使用ELISA（尿密蛋白-3（cat.KL-CLDN 3-Ra;上海康朗生物科技有限公司，有限公司、中国）; L-FABP（目录号ARB 12324; BeijingBioRab Technology Co. ， 有 限 公 司 、 中 国 ） ; 和 I-FABP（cat.ARB14534; Beijing BioRab Technology Co.，Ltd.））。2.6. 实时定量聚合酶链反应评估claudin-3和L-FABP的表达采用实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测肠组织中claudin-3和L-FABP的表达。用NucleoZOL试剂（Machery-Nagel，德国）以每100 mg组织的比率分离总RNA。ImL NucleoZOL，并使用QuantScript RT试剂盒（TIANGEN，中国）进行逆转录成互补DNA（cDNA）。将所得cDNA用作模板。RT-qPCR引物来自已发表 的 参 考 文 献 ， 如 表 1 所 示 [20 ， 21] 。 甘 油 醛 -3- 磷 酸 脱 氢 酶（GAPDH ）用作内部参考。使用 ABI 7500 实时聚合酶链反应（PCR）系统（Applied Biosystems，USA）进行RT-qPCR反应条件如下：在95°C下预变性30秒，然后进行40个循环的熔融（95°C， 10 s）和退火。延伸（60°C持续30秒）。每个模板的PCR反应是P. Han，L.- S.李志X. Wang等人工程15（2022）115117·····--图1.一、动物模型的建立和评价。（a）研究的实验设计;（b）血清特异性免疫球蛋白E（IgE）水平;（c）鼻粘膜中粒细胞的密度数据表示每组8只大鼠的平均值±标准差（SD）*p0.001，使用表1本研究中使用的引物序列引物名称引物序列（50紧密连接蛋白-3（正向）CATCCTGCTGGCCGCCTTCGClaudin-3（反向）CCTGATGATGGTGTTGGCCGACL-FABP（正向）CCTCATTGCCCATATGAACTTCTCCGGL-FABP（反向）AGCGGATCCTAAATTCTTGCTGACTCGAPDH（正向）GCCACATCGCTCAGACACCAGAPDH（反向）CTCAGCCTTGACGGTGCCAT在96孔板中一式三份进行采用循环阈值（Ct）值比较模型组和对照组的基因表达水平2.7. 微生物多样性分析使用E.Z.N. A. ®土壤DNA试剂盒（Omega Bio-tek，USA）根据制造商用引物338 F（5 0 - ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3 0）和80 6R（5 0 -GGACTACHVG）扩增细菌16 S核糖体RNA（rRNA）基因的V3-GGTWTCTAAT-30）。然后从2%琼脂糖凝胶中提取PCR产物，并使用AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒（Axygen Biosciences，USA）纯化。然后对纯化的扩增子进行Illumina MiSeq测序分析。2.8. 粪便样品中短链脂肪酸的靶向分析该程序改编自先前发表的方案[22]。将所选短链脂肪酸（SCFA）的储备溶液溶解在丙酮中，乙酸的浓度为501 g mL-1，丙酸和丁酸的浓度为21 g mL-1校准曲线（浓度为50、100、250、500、1000、2500、25000、250000、25000、12 500、25 000和50 000 ng mL-1; 2、4、10、20、40、100、200、500、1000和2000 ng mL-1），用于SCFA的定量。将每份粪便样品称重，并在室温（20-25 °C）下在8倍（g mL-1）丙酮中浸泡3 h。在2450转离心之前，将样品涡旋直至混合物均匀在4 °C下以每分钟（rpm）的速度搅拌5分钟。收集上清液用于气相色 谱 （ GC ） 分 析 。气 相 色 谱 仪 （ GC- 2014; ShimadzuCooperation）用于分离SCFA，参数从文献中获得[22]。2.9. 统计分析在R Studio中的“XCMS”软件包内处理获得的GC-MS数据（峰拾取和比对）。在R中分别归一化后，质量控制（QC）样品中相对标准偏差30%且存在于70%样品中的特征被包括用于随后的多变量分析。在对数转换和帕累托标度之后，对数据进行正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）。然后，根据协方差P[1]和相关性Pcorr值（P[1] > 0.05，Pcorr>0.8，或P[1] 0.05，Pcorr0.6），应用源自该OPLS-DA模型的S图选择特征。所有多变量分析均使用SIMCA版本14（MKS Umetrics AB，瑞典）进行[23]。在原始数据中对所选的最差异表达特征进行半定量。特征水平表示为峰面积与内标物峰面积的比值。通过比较检测到的代谢物的裂解模式与美国国家标准与技术研究所（NIST）的光谱进行鉴别。为了比较对照组和模型组，使用单变量非参数Mann-Whitney检验（双侧）检查代谢特征或鉴定的细菌菌株的水平。研究每种代谢产物与细菌菌株与花粉热生物学变量，斯皮尔曼使用免费在线Majorbio云平台（Shanghai Majorbio Bio- Pharm Technology Co.，有限公司、中国）。3. 结果3.1. SD大鼠花粉热的特征在激发阶段（从第20天至第25天），在模型中观察到显著的花粉抗原诱导的鼻部症状P. Han，L.- S.李志X. Wang等人工程15（2022）115118组老鼠在受到花粉提取物的攻击后不久就开始打喷嚏和抓鼻子。为了进一步确认花粉热的发展，在对大鼠实施安乐死后测量血清特异性IgE水平。正如预期的那样，模型组中的大鼠在激发期结束时显示出IgE水平的显著增加（增加约1.5倍，p0.001），证明所建立的模型是成功的。此外，在激发期结束时，模型组鼻粘膜中的颗粒细胞密度也高于对照组（图1A和1B）。1（b）和（c），以及附录A中的图S1）。3.2. 花粉热在确认该模型的实用性后，我们使用血浆样品的代谢分析来深入了解与花粉症相关的任何检测到对照组和模型组之间血浆代谢谱的明显差异，如OPLS-DA模型所证明的，表明生物化学改变（图1B）。2（a））。为了确定哪种代谢特征是对照组和模型组之间最强的区分因子，相应的相关性S图（图11）。 2（b））用于根据第2节中规定的标准生成感兴趣特征的列表。选择了14个对原始数据和NIST文库进行比对后，得到相似性指数大于85的12个氨基酸序列，分别为缬氨酸、胆固醇、柠檬酸、苏氨酸、尿素、异亮氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、吲哚丙酸（IPA）和肌醇。然后，在原始数据中测量所选特征的峰面积从分析中排除胆固醇、柠檬酸盐、苏氨酸和尿素，因为差异无统计学显著性。支链氨基酸亮氨酸在模型组中未显示模型组中缬氨酸和异亮氨酸均大幅降低，倍数变化分别为0.57和0.52;因此，我们不排除亮氨酸。模型组中天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、IPA和肌醇的血浆水平下降（p0.05;图2（c））。其中，IPA是肠道微生物衍生的代谢物，其减少1倍，如图所示。 2（c）.3.3. 粪便微生物群由于肠道生态失调与过敏性疾病有关，并且在我们的研究中观察到肠道衍生代谢物的变化，因此分析粪便微生物组组成以探索组成差异，以及模型组中改变的微生物组与宿主中循环代谢物相关的程度。如上所述，处理粪便样品进行16S rRNA测序共分析了998342个读段，并聚类为835个操作分类单位（OTU）。与对照大鼠相比，模型大鼠显示出明显的微生物改变，如观察到的OTU的OPLS-DA所证明的（图1B）。 3（a））。为了检查花粉过敏大鼠中微生物群的具体变化在大鼠粪便样品中鉴定的门中，仅在模型组中存在疣微菌属。厚壁菌门和拟杆菌门是优势门，模型组中厚壁菌门与拟杆菌门的比例低于对照组，为0.67，表明厚壁菌门的生物体丰度较低（图3（b））。在科水平上，瘤胃球菌科和毛螺菌科的相对丰度下降，图二、来自对照和模型大鼠的血浆样品的代谢谱（a）显示基团分离的OPLS-DA模型。(b)用于特征选择的相应S图。每个点代表一个特征，红色的点是根据第2节中规定的标准选择(c)显示对照组和模型组之间数据表示每组8只大鼠的平均值± SD使用Mann-Whitney检验，*p 0.05，**p0.01。NS：无统计学意义。而模型组中普雷沃氏菌科和阿克曼氏菌科的含量增加（图1B）。 3（c））。在属水平上，在模型组和对照组之间也观察到显著的变化，其中模型组含有较少的细菌菌株（图1）。 3（d））。大鼠表现出属于瘤胃 球 菌 科 、 毛 螺 菌 科 （ Blautia ） 和 梭 菌 目 （ Romboutsia ，Clostridiales）的几个有益属Ruminococcaceae_UCG-005的比例从10%降 至 3% ， Ruminococcaceae_UCG-009 从 0.075% 降 至 0.025% ，Ruminococcaceae_NK4A214_组从1.1%降至0.03%。在毛螺菌科中，P. Han，L.- S.李志X. Wang等人工程15（2022）115119图三.不同层次的微生物多样性分析。(a)OPLS-DA评分图;（b）基于门水平的群落分析;（c）基于科水平的群落分析;（d）显示前45个属的热图。毛螺菌科_FCS020_群和布劳特氏菌属的相对丰度分别从0.05%和2%下降到0.02%和0.1%。未分类_o_梭菌和Romboutsia减少，倍数变化为0.85和0.74（p0.05，图4）。模型组梭状芽孢杆菌Sensu_stricto_1有趣的是，Akkermansia、Prevotellaceae_Ga6A1_group和螺杆菌仅在模型组中检测到，而在对照组中未检测到（图4）。除这些差异外，对照组中结瘤真杆菌群的水平也较模型组高4倍3.4. SCFAs和上皮细胞完整性的变化为了支持SCFA生成微生物群落减少的发现，我们测定了三种主要SCFA（乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐）的粪便水平我们还检查了粪便代谢组学检测到的单糖，已知这些单糖经过细菌发酵产生这些SCFA。粪便中SCFAs和单糖的浓度存在显著差异。 如图在图5（a）和（b）中，乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐水平显著降低。因此，测定的两种单糖在模型组中积累。该分析表明，由于模型组中的肠道生态失调，发酵效率部分降低，这证实了对照大鼠和模型大鼠之间SCFA生成微生物组丰度的差异由于先前的研究表明SCFAs和我们研究中检测到的其他干扰代谢物在维持上皮屏障中的作用，我们评估了肠道完整性。L-FABP和I-FABP是上皮细胞完整性的生物标志物，而claudin-3属于紧密连接蛋白组;因此，我们首先在蛋白水平上测量它们。结果显示，在模型组中，尿密蛋白-3和L-FABP水平较低，而I-FABP 水平没有可检测的变化（图1B）。 5（c））。Claudin-3和L-FABP分别降低1.22和1.97倍。然后，我们在转录水平上研究了肠密蛋白-3和L-FABP的量。如预期的，它们的表达在模型组中下调，并且在转录水平上的降低程度甚至高于蛋白质水平，对于claudin-3为3.29倍，对于L-FABP为1029.76倍（图5（d））。这些观察结果表明肠道完整性受损。3.5. 代谢特征、肠道微生物组和生物测量为了确定代谢物的相对数量、肠道细菌的相对丰度和生物学测量值之间是否存在任何相关性3株细菌与血清IgE水平呈显著相关，分别为螺杆菌、结节真杆菌群和狭义梭菌1型。在这三种细菌菌株中，螺杆菌与几乎所有的血浆代谢产物都有很强的虽然没有P. Han，L.- S.李志X. Wang等人工程15（2022）115120--图四、干扰细菌菌株的单变量分析数据表示每组6只大鼠的平均值± SD使用Mann-Whitney检验，*p 0.05，**p 0.01ND：未检出。检测到毛螺菌_FCS020_群与血清IgE之间的相关性，与异亮氨酸、IPA、肌醇呈正相关至于代谢物，只有IPA和血清IgE呈负相关（图11）。 6）。紧密连接蛋白-3与血清IgE水平负相关（r = 0.77，p = 0.013，图7（a）），与缬氨酸、谷氨酸、IPA、天冬氨酸和肌醇正相关（图7（a））。 7（b））。值得注意的是，在密蛋白-3和螺杆菌之间存在强关联，并且螺杆菌是唯一与密蛋白-3显著相关的属（r = 0.79，p =0.009，图1B）。 7（c））。L-FABP与布劳特氏菌群呈正相关，与阿克曼氏菌群和普雷沃氏菌群呈负L-FABP水平与血清IgE或血浆代谢物水平之间无相关性4. 讨论在七种下调的氨基酸或其衍生物中，支链氨基酸（BCAA）缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸是必需的，并且不能由人合成由于对照组和模型组的大鼠接受相同的食物，BCAA的下降趋势可能归因于花粉致敏引起的肠道微生物群的异常蛋白质发酵。然后，我们将数据与春季花粉所致AR患者的结果进行了比较。所有BCAA在癫痫发作阶段表现出相似的降低趋势，亮氨酸显著降低1.14倍[24]。IPA是色氨酸的细菌衍生代谢物[25]。色氨酸也是一种必需氨基酸。与支链氨基酸类似，IPA的不同水平也可能是由于代谢能力的改变，肠道微生物通过16S rRNA测序检测到的肠道微生物群的生态失调证实了这些变化，异亮氨酸与毛螺菌科_FCS020_组正相关，而缬氨酸与螺杆菌负相关。据报道，一些细菌菌株可产生IPA。在我们的情况下，我们没有发现报道的细菌菌株;相反，我们发现IPA与瘤胃球菌科_UCG-005、螺杆菌、毛螺菌科_FCS020_组和结节真杆菌_组的相对丰度密切相关。其中，Ruminococcaceae_UCG-005、Lachnospiraceae_FCS 020_group和Eubacterium_nodatum_group均属于梭菌目，可将色氨酸代谢为IPA[26]。此外，在人体样本中报告了IPA血清水平与瘤胃球菌科菌株之间类似的正相关性[27]。因此，这些肠道细菌丰度的降低可能归因于IPA水平的降低研究发现，IPA可通过激活胆甾烷X受体来调节小鼠的肠屏障功能，从而进一步上调紧密连接蛋白（如claudins和occludins）的表达[28]。IPA是唯一与IgE水平显著相关的代谢物，这可能在一定程度上解释了模型组claudin-3表达抑制的原因。谷氨酰胺是哺乳动物体液中丰富的非必需氨基酸，已被证明是肠粘膜屏障功能的重要营养素[29，30]。作为快速分裂细胞的主要底物，它可以调节紧密连接蛋白的表达，包括claudin-1，occludin和zonula occludens-1（ZO-1）。谷氨酰胺的脱乙酰化可能导致这些蛋白质的减少和肠绒毛的萎缩[29补充谷氨酰胺可主要通过激活Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶来改善这种完整性的丧失P. Han，L.- S.李志X. Wang等人工程15（2022）115121图五.（a）粪便SCFA，（b）粪便单糖，（c）蛋白质水平的L-FABP、密蛋白-3、L-FABP和I-FABP，和（d）转录水平的密蛋白-3和L-FABP的测量。使用Mann-Whitney检验，*p0.05，**p激酶2-腺苷50-单磷酸激活的蛋白激酶信号通路，其增加紧密连接蛋白的水平[30]。支链氨基酸也有助于肠道屏障功能。BCAA的缺乏，尤其是异亮氨酸，可能导致免疫功能受损和病原体易感性增加[32，33]。异亮氨酸可诱导上皮细胞和免疫细胞中b-防御素的表达，其在哺乳动物先天免疫中发挥作用[34]。此外，异亮氨酸可以为动物组织中谷氨酰胺的合成提供氮，如上所述，缺乏异亮氨酸会抑制紧密连接蛋白的表达[35]。异亮氨酸和谷氨酰胺之间的这种相互作用在一定程度上被证明是由它们之间的显着正相关，如我们的研究中所观察到的。缬氨酸缺乏还通过推进促炎细胞因子同时阻止抗炎细胞因子而损害肠的免疫屏障。同时，缬氨酸的缺乏通过抑制occludin、claudin-3和ZO-1的转录来干扰物理屏障，从而降低肠的屏障功能[36]。因此，如我们的研究中所观察到的，由于缬氨酸和密蛋白-3之间的强正相关性，降低的缬氨酸水平也可能有助于抑制密蛋白-3的表达。屏障完整性的破坏可能导致肠道渗透性增加，允许细菌移位以及过敏原和蛋白质渗透增加[29，37，38]。因此，这些结果表明，肠道屏障功能障碍可能参与了花粉症的病理。巧合的是，观察到的肠道生态失调也可能导致肠道屏障功能异常。与对照组相比，来自厚壁菌门的微生物的相对丰度模型组门细胞数较低。在患有气道过敏的儿童中也报告了这种减少[39]。在厚壁菌门的降解菌中，大多数是能将膳食纤维代谢成SCFA的菌株，包括结真杆菌群、瘤胃菌科和毛螺菌科的菌株以及梭菌属的菌种瘤胃球菌科和毛螺菌科是丁酸盐的主要生产者[40]。梭菌主要产生丙酸盐[41]。肠道微生物群落的这种变化与乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐（三种最丰富的SCFA）的水平下降以及单糖的积累水平一致。来自瘤胃球菌科和毛螺菌科的物种已被证明对鸡蛋过敏具有判别力，但在这些研究中，毛螺菌科和瘤胃球菌科的属的丰度增加与儿童的鸡蛋致敏有关，这与我们的观察结果不同[42]。SCFAs作为肠道上皮细胞的重要燃料，特别是丁酸盐，其是结肠上皮细胞的优选能量来源，并且对于维持健康的肠道是必不可少的[43，44]。SCFA也是肠道免疫应答以及上皮保护功能的重要介质[45，46]。SCFA刺激肠中紧密连接蛋白的表达它们还可以降低凋亡细胞的百分比，减弱脂多糖诱导的细胞旁通透性增加，并最终促进上皮细胞的完整性和修复[47，48]。具体而言，微生物衍生的丁酸盐主要在肠道内执行关键功能。它增加了上皮细胞对氧气的消耗，P. Han，L.- S.李志X. Wang等人工程15（2022）115122图六、血浆代谢产物、IgE水平与肠道菌群的相关性分析稳定的低氧诱导因子，其参与协调屏障保护功能[44，49，50]。乙酸通过减少炎性细胞因子的合成而具有抗炎作用[51]。除了产生SCFA，这些细菌菌株在维持肠道和全身免疫稳态中发挥作用。发现来自健康人样品的梭菌菌株可增强调节性T细胞丰度，并且这些菌株的施用可阻断对食物过敏原的致敏作用并减轻过敏性腹泻[52，53]。除了产生SCFA的细菌外，螺杆菌也引起了我们的注意，因为它与IgE和claudin-3水平呈强负相关。研究表明，幽门螺杆菌（Helicobacterpylori，H. pylori）对紧密连接蛋白分子和紧密连接蛋白组成在胃上皮细胞中的表达具有负面影响，导致小分子和大分子穿过消化上皮的通道增加[54]。H.幽门螺杆菌还改变胃上皮结构，导致胃屏障功能受损，并且许多其它螺杆菌引起人类疾病[55，56]。鉴于肠粘膜是螺杆菌属的天然栖息地，在我们的研究中模型组中出现的螺杆菌菌株可能对肠上皮细胞中的claudin-3表达具有负面影响，导致肠对过敏原的渗透性增加[57]。最近有报道称H.幽门螺杆菌可能与过敏性疾病的发展有关。例如，在一个示例中，Dautriche等人[58]描述了一个独特的病例，其中持续性皮肤超敏反应与H.观察到幽门螺杆菌感染。另一个值得注意的属是Akkermansia，其仅在模型组中检测到，并且与L-FABP呈负相关嗜粘蛋白阿克曼氏菌被认为是有前途的“下一代益生菌”. 研究表明，嗜粘蛋白阿克曼氏的丧失与年龄诱导的肠道通透性相关，其给药可能通过增加内源性大麻素的体内水平来调节肠道屏障功能[59，60]。此外，嗜粘蛋白阿克曼氏菌衍生的细胞外囊泡已被证明是控制肠道通透性的功能部分[61]。然而，在我们的研究中，模型组中有更多的嗜粘蛋白阿克曼氏菌。最近基于来自五个国家的数据集的荟萃分析显示，人类肠道中Akkermansia属的过表达通过增加肠道渗透性和使肠道神经丛易受氧化应激影响而与帕金森病进展相关嗜粘蛋白阿克曼氏菌是一种粘蛋白降解细菌，已在2型糖尿病患者中检测到其增加[63]。粘蛋白是粘液层的组成部分，其形成肠防御系统的第一物理屏障并保护上皮细胞免受化学、酶和微生物的侵害[64]。因此，模型组中富集的阿克曼氏菌属可能通过降解粘液层并使上皮完整性丧失，P. Han，L.- S.李志X. Wang等人工程15（2022）115123图7.第一次会议。（a）密蛋白-3与IgE水平，（b）密蛋白-3与血浆代谢物，（c）密蛋白-3与螺杆菌，以及（d）L-FABP与肠道细菌菌株之间的相关性分析易接触过敏原的上皮。在患有肠缺血的大鼠中也观察到了这种由粘蛋白破坏引起的肠功能受损[65]。由于结果不一致，嗜粘蛋白阿克曼氏菌与肠道完整性的关系需要进一步研究。普雷沃氏菌科Ga6A1菌群是普雷沃氏菌科中的一种粘液相关细菌菌株，其在发炎粘膜中具有较高的转录活性[66]。据报道，普雷沃氏菌科的一些未知成员与高炎症性疾病易感性相关，普雷沃氏菌属可能加剧肠道炎症[67，68]。Prevotellaceae_Ga6A1_群的扩大代表性可能与过敏性炎症有关。紧密连接蛋白是紧密连接的主要组分，其形成紧密连接链以密封上皮中的细胞旁途径，防止管腔抗原摄取[69]。在claudin蛋白中，claudin-3是紧密连接的核心组分，可作为肠道屏障完整性的标志物[70]。因此，在肠部位紧密连接蛋白-3（“收紧”紧密连接蛋白）的表达显著降低此外，观察到的下降claudin-3水平也与血清IgE水平的增加密切相关，表明claudin-3的变化可能对花粉热的发展有影响。Claudins已被证明是哮喘患者气道上皮屏障功能障碍的生物标志物，但这种泄漏的确切机制需要进一步研究[71]。在特应性皮炎（AD）患者中，检测到了claudins的表达紊乱。Yamaga等人[72]描述了紧密连接蛋白-3表达异常降低在AD发病机制中的作用。L-FABP主要定位于小肠，并在肠上皮细胞中表达。其循环水平已被证明是肠粘膜损伤的非侵入性生物标志物[73，74]。此外，数据显示L-FABP有助于膜完整性和细胞形态的保存，脂肪酸结合蛋白与肠上皮细胞质量损失相关[75]。我们的研究结果以及相关研究表明，检测到的螺杆菌和阿克曼氏菌同时，由于肠道微生物群生态失调，肠粘膜营养代谢物如缬氨酸和丁酸盐的缺乏进一步驱动肠屏障的功能障碍，从而导致对花粉的过敏。P. Han，L.- S.李志X. Wang等人工程15（2022）1151245. 结论总之，肠道屏障完整性的破坏被认为与花粉热病理学有关。具体而言，缬氨酸、IPA、SCFA减少以及螺杆菌和阿克曼氏菌物种增加可能抑制肠中紧密连接蛋白表达和粘液层形成，从而导致肠上皮防御功能障碍（肠漏），这使得宿主易于发生花粉热。在这些条件下，其他肠上皮细胞营养代谢物和SCFA产生细菌的变化进一步增强了药物渗透性。这些发现不仅提供了关于花粉热发展中微生物功能的重要信息，而且还表明逆转肠道渗漏可能是花粉热预防和管理的有效和有力的策略。此外，建议在生化、细胞和临床水平上进一步探索因果关系。致谢本 研 究 得 到 了 国 家 自 然 科 学 基 金 的 资 助 （ 81971515 和81973290），CAMS医学科学创新基金（2016-I2 M-3-011和2016-I2 M-1-003 ）， 非临床药物代谢与PK/PD研究北京市重点实验室（ Z141102004414062 ） ， 国 家 创 新 药 物 重 大 项 目 （ 2018 ZX09711001 -002-002 ） ， 北 京 市 自 然 科 学 基 金 重 点 项 目（ 7181007 ） ， 北 京 协 和 医 学 院 中 央 高 校 基 础 研 究 基 金（3332020037）、北京市医院管理局临床医学发展专项资金支持（ZYLX 201826）。作者感谢岛津（中国）有限公司，技术支持。遵守道德操守准则Pei Han 、 Li-Sha Li 、 Zi-Xi Wang 、 Lin Xi 、 Hang Yu 、 LinCong、Zheng-Wei Zhang、Jie Fu、Li-Bin Pan、Shu-Rong Ma、Ran Peng 、 Xue-Yan Wang 、 Hong-Tian Wang 、 Xiang-DongWang、Yan Wang、Jin-Lyu Sun和Jian-Dong Jiang声明他们没有利益冲突或财务冲突需要披露。附录A.补充数据本文的补充数据可在https://doi.org/10.1016/j.eng.2021.03.013上找到。引用[1]第一章B W. 花粉热。 Nature 1923;111（2798）：812[2] 2005年10月20日，第一届世界卫生组织（WHO）第一次世界儿童和青少年对桃树花粉和桃9的致敏和变态反应。Int Arch Allergy Immunol 2019;180（3）：212-20.[3] [10] Jakartsis D，Berger U，Tzima F，Karatzas K，Jaeger S，Bergmann KC.花粉过敏性鼻炎患者的个性化症状预测。国际生物统计学杂志2015;59（7）：889-97。[4] [10]杨文，李文，李文.花粉变应原分子诊断。Curr Allergy Asthma Rep2016;16（4）：31.[5] WangXY，Ma TT，Wang XY，Zhuang Y，Wang XD，Ning HY，et al. 中国北方草原花粉暴露量高的花粉诱发变应性鼻炎的患病率过敏2018;73（6）：1232-43。[6] 谢志杰，关坤，尹军。花粉致季节性过敏性哮喘的临床及机制研究进展。 美国临床实验免疫学杂志2019;8（1）：1-8。[7] Wambre E，Bajzik V，DeLong JH，O ' B r i e n K ， N g u y e n Q A ， S p e a k eC ， et a l . 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