TFMLAB：4D牵引力显微镜的MATLAB工具箱

软件X 15（2021）100723原始软件出版物TFMLAB：用于4D牵引力显微镜的MATLAB工具箱Jorge Barrasa-Fanoa，Apeksha Shapetia，Álvaro Jorge-Peñasa，Mojtaba Barzegaria，José Antonio Sanz-Herrerab，Hans Van Oosterwycka，c，a比利时鲁汶大学机械工程系生物力学部分b西班牙塞维利亚大学工程高级技术学院cPrometheus，Division of Skeleton Tissue Engineering，KU Leuven，Leuven，Belgiumar t i cl e i nf o文章历史记录：2020年12月18日收到收到修订版，2021年4月2日接受，2021年保留字：牵引力显微镜图像处理有限元法a b st ra ct我们提出了TFMLAB，一个MATLAB软件包的4D（x;y;z;t）牵引力显微镜（TFM）。虽然文献中有各种TFM计算工作流程，但技术经验有限的研究人员易于使用并且可以分析4D体外系统的开源程序并不存在。TFMLAB集成了所有的计算步骤，从共聚焦显微镜图像计算主动细胞力，包括图像处理，细胞分割，图像对齐，基质位移测量和力恢复。此外，TFMLAB通过交互式图形用户界面简化了可用性这项工作描述了包版权所有©2021作者。由爱思唯尔公司出版这是CC BY-NC-ND下的开放获取文章许可证（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。代码元数据当前代码版本v1.0此代码版本使用的代码/存储库的永久链接https://github.com/ElsevierSoftwareX/SOFTX-D-20-00104法律代码许可证LGPL v3.0使用Gitlab的代码版本控制系统使用MATLAB的软件代码语言、工具和服务编译要求，操作环境依赖性图像处理工具箱，信号处理工具箱（MATLAB），DIPImage库，Elastix如果可用开发人员文档/手册链接https://gitlab.kuleuven.be/MAtrix/Jorge/tfmlab_public/-/blob/public_tfmlab/manual.pdfkuleuven.be支持电子邮件1. 动机和意义机械生物学是一门研究机械信号和生物反应之间相互作用的学科，在过去的20年里得到了长足的发展。机械力在驱动细胞行为中的重要性现在在文献[1同时，牵引力显微镜（TFM）已成为量化细胞-基质界面力的首选方法。通常，通过光学显微镜对与细胞和基准标记物混合的合成或天然水凝胶进行成像*通讯作者：比利时鲁汶大学机械工程系生物力学部分.电子邮件地址：jorge. kuleuven.be（Jorge Barrasa-Fano），apeksha.kuleuven.be（Apeksha Shapeti），alvaro. soundtalks.com（Álvaro Jorge-Peñas），mojtaba. kuleuven.bejsanz@us.es（Mojtaba Barzegari），(Jos Antonio Sanz-Herrera），hans. kuleuven.be（Hans VanOosterwyck）.https://doi.org/10.1016/j.softx.2021.100723在（应力状态）和（松弛状态）细胞松弛之前。图像处理算法通过跟踪基准标记在这两种状态之间的移动来测量细胞外基质（ECM）上的细胞力诱导的变形。最后，通过应用将力与变形相关联的力学模型来检索单元力。读者可以参考该领域的优秀评论以了解更多细节[3，5，6]。TFM传统上用于研究2D体外培养中的细胞力学，其中细胞接种在基质上[7在2D（即2D细胞培养的2D位移和力计算）和2.5DTFM（即2D细胞培养的3D位移和力计算）中使用的几个开源MATLAB软件包是可用的：位移测量算法，如粒子图像测速（PIV）[10]和粒子跟踪（PT）[11]，或用于力恢复的正则化技术[12]。此外，目前的挑战在于提供TFM2352-7110/©2021作者。由爱思唯尔公司出版。这是一篇开放获取的文章，使用CC BY-NC-ND许可证（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表SoftwareX期刊主页：www.elsevier.com/locate/softxJorge Barrasa-Fano，Apeksha Shapeti，Álvaro Jorge-Peñas等人软件X 15（2021）1007232+K用于生理学上更相关的3D实验（细胞完全嵌入水凝胶中）和结合时间依赖性（4D）。与2D TFM不同，3D TFM开源工具的可用性非常稀缺。目前正在发表3D TFM研究的一些团体没有提供源代码[18其他人提供源代码，但缺乏力计算功能[22]。一个例外是Fabry小组的开源贡献。他们开发了SAENO[23]，这是第一个开源的3DTFM求解器，用于非线性，非线性材料，如胶原蛋白和纤维蛋白。虽然它仍然是一个独特的贡献领域，我们在此解决两个限制其可用性的研究人员有限的技术经验。首先，该软件不提供计算中涉及的中间步骤的反馈（例如图像滤波或偏移校正），这需要用户具有更高的技术专业知识来为每个样本选择最佳输入参数[24]。其次，虽然图像的信噪比在很大程度上取决于显微镜的类型或所使用的水凝胶，但SAENO不允许根据新数据调整图像处理操作，因为它们对用户是隐藏的。最近，他们发布了jointforces，一个开源Python包[25]。虽然他们将其应用于肿瘤球体的3D体外模型的数据，但该软件仅计算球体赤道面处的2D力通过TFMLAB，我们提供了一个实验人员可以输入原始显微图像，并通过交互式图形用户界面（GUI）进行参数调整。用户可以选择不同的图像滤波器来处理各种类型的数据，并使用自由形式变形（FFD）算法进行位移测量。特别是，FFD已被证明优于PIV，并已用于各种实验研究，涉及单细胞和多细胞系统中的2D，3D和4D（时间推移）测量[26最后，我们最近发表的基于物理的非线性反演方法（PBNIM）[31，32]。TFMLAB将复杂的最新技术方法结合到一个封闭且用户友好的软件中，该软件不需要代码处理，并允许在生物学研究中应用4DTFM，这对机械生物学具有很强的前景2. 软件描述2.1. 软件构架我们在MATLAB框架中开发了TFMLAB，以提供强大且用户友好的显微镜数据处理。该软件有一个主函数main.m，它在计算TFM的每一步调用其他例程（见图1示意图）。①的人。但是，用户只需要与TFMLAB的GUI进行交互。简而言之，TFMLAB具有以下步骤：（1）显微图像读取，（2）图像处理，（3）位移测量，以及(4)受力计算在每一步之前都有一个GUI用于参数调整，结果文件夹存储在步骤之间。虽然MATLAB编排了工作流程，但一些特定的操作是由外部软件执行的（参见表1）。2.2. 软件功能用户必须首先在MATLAB中运行脚本main.m，并执行图1所示的步骤。 1跟随，要求用户通过不同的GUI进行交互。2.2.1. 显微图像读取首先，用户必须提供输入数据。 GUIset_inputs将请求输入显微镜文件。为了提高灵活性，TFMLAB使用Bio-Tags工具箱，该工具箱可以读取多种显微镜文件格式[35]。从输入文件中，软件读取与单元格相对应的通道（例如，在用LifeAct转导后成像用于丝状肌动蛋白染色）和基准标记如荧光珠和/或纤维（例如，在纤维状胶原水凝胶通过二次谐波产生成像的情况下[27]）。任何其他通道（例如，亮场、核.. .），因为它们对于TFM不是必需的。只要水凝胶的视场保持恒定，用户可以为给定样品提供任何数量的图像（时间点）。所有图像被认为符合应力状态的不同时间点，而最后提供的图像被认为是放松状态。然后，函数microscope2Tif将输入数据转换为.tiff文件。这是一种标准格式它保持了位深度，并且很容易通过任何免费软件（如ImageJ）访问。数据按通道（细胞、微珠和/或纤维）和时间点（tp_01、tp_02、. .，tp_R）并存储在A_rawImagesTiff输出文件夹中。2.2.2. 图像处理GUIset_imProcessing允许用户交互式地调整图像过滤和增强参数。TFMLAB为细胞、微珠和纤维图像提供了特定的过滤器，以及用于细胞分割的工具。MATLAB图像处理工具箱和DIPImage库[36]结合了多个滤波选项，以实现多功能性（参见附录B中的更多细节和第3节中的示例）。然后，main函数调用函数timeSeries-ImFilt和timeSeriesCellSeg来处理所有输入图像，并将它们存储在B_filteredImages输出文件夹中。刚性图像配准是在第一个移位校正步骤，纠正任何显微镜载物台相关的漂移。首先，进行相位相关操作以使用函数timeSeriesShift-Calc计算所有图像与参考图像之间的移位。如果仅提供两个图像，则参考是松弛图像。否则，参考 为 中 间 时 间 点 。 珠 / 纤 维 图 像 用 于 此 操 作 。 其 次 ， 函 数timeSeriesShiftCorrection根据计算的偏移对齐所有通道的图像，并且裁剪任何不重叠的图像边界，使得所有图像在操作结束时具有相等的大小。生成的图像存储在C_shiftCorrectedImages输出文件夹中。2.2.3. 位移测量位移测量通过基于FFD的图像配准完成[26]。简而言之，多变量B样条函数扭曲运动图像（在应力状态的某个时间点处的标记图像，Mk）以优化量化其与固定图像（表示松弛状态的标记图像，MR）的相似性的距离度量的值。使用GUIset_dispCalc，用户可以在不同的优化器、距离度量之间进行选择，并且可以调整B样条曲线的控制点之间的间距，以使其适应每个样品的实验条件（详见附 录 C ） 。 然 后 ， main 函 数 调用 timeSeriesDispCalc ， 它 使 用Elastix工具箱进行有效的图像配准，如前所述[29，30，42]。细胞分割Sk可以用作掩模以忽略被细胞吞噬的珠。图像配准的参数和性能文件存储在输出文件夹D_1_calcElastix中。通过第二次移位校正，然后针对timeSeries- DispShiftCorr中的任何虚假刚性移位校正测量的位移场umeas，并将其存储在文件夹D_2_displacements中。通过从整个图像堆栈的每个位移场分量还校正了Jorge Barrasa-Fano，Apeksha Shapeti，Álvaro Jorge-Peñas等人软件X 15（2021）1007233KKK乌米亚斯Fig. 1. TFMLAB的基本流程图。在细胞培养和显微镜成像（左手侧）之后，用户可以将标记物（Mk）和细胞（Ck）图像堆栈输入到TFMLAB（顶部）中。工作流的主要步骤（中间）、GUI脚本、执行这些步骤的关键MATLAB函数的名称以及输出文件夹软件生成的（右侧）。简而言之，在图像处理之后，通过自由测量法测量标记图像中的位移（u_meas）。形状变形（FFD）。这些位移以及细胞和水凝胶的有限元（FE）网格用于计算改进的位移ucalc 和它们的相关牵引力Tk，其用基于物理的非线性逆方法（PBNIM）实现水凝胶中的力的平衡。免费使用的图标可从[33，34]。表1TFMLAB中使用的外部软件。请注意，Abaqus和FreeFEM是两种FE求解器替代方案。其中只有一个是必要的力计算。软件/工具箱免费提供随TFMLAB使用生物格式[35]是的是的显微图像读取DIPImage [36]是的没有图像处理：图像滤波和增强Elastix [37]是的是的位移测量：FFD图像配准Paraview [38]是的没有（可选）结果可视化[39]第三十九话是的是的力计算：自动有限元网格划分[40]第四十话是的是的力计算：PBNIM方程组Abaqus没有没有力计算：FE求解器FreefEM [41]是的没有力计算：替代FE求解器相 应地 并存 储在 D_3_postShiftCorrectedImages 中 。最 后， 函 数results2paraview在自由软件Paraview中生成用于矢量场和细胞分割可视化的.vtk文件[38]，并将其存储在文件夹E_resultsParaview中。2.2.4. 力计算要求用户调整GUIset_tracCalc中的力计算参数。细胞分割Sk被用于创建一个各向同性行为）。由于仅在某些离散位置（珠/纤维）处测量位移场u，因此它不是无误差的，并且牵引力恢复通常通过应用正则化技术来完成以避免过拟合。在TFMLAB中，我们使用了我们的新型PBNIM方法，该方法在计算机模拟和体外实验中被证明比非正则化方法更准确[31，32]。简单地说，该方法计算位移场u calc，其与测量的位移场相差最小，使用开源网格生成器iso2mesh对细胞表面和水凝胶域进行有限元（FE）网格[39]。 所得的3D四面体网格远离细胞表面更粗糙。GUI允许调整元素大小和平滑（详见附录D）。此外，用户可以定义水凝胶的机械参数，例如弹性模量或泊松KK这是一种强制性的，以实现在hy中的力的平衡。drogel域作为约束（详见附录B）。PBNIM在函数tractionRecovery中实现。由于PBNIM是使用FEM框架开发的，因此需要FE求解器。TFMLAB与两种FE求解器兼容，即商用Abaqus（DassaultSystemesSimuliaCorporation，Providence，RI）和开源软件FreeFEM [41]。用户Jorge Barrasa-Fano，Apeksha Shapeti，Álvaro Jorge-Peñas等人软件X 15（2021）1007234××××∼∼也可以选择其中一个FE求解器来计算牵引力。刚度矩阵通过选定的FE解算器计算。如果选择Abaqus，TFMLAB将为其提供一个自动编写的作业文件，并将结果导入回MATLAB工作区。同样，TFMLAB自动与FreeFEM交互，我们为此开发了特定的FreeFEM例程。最小化问题（Eq.（E.3））然后解析导出，转化为通过函数spqr_solve求解的方程组，该函数是开源工具箱SuiteSparse [40]的一部分。这给出了位移场ucalc，与umeas不同，它满足表2给定示例的TFMLAB每一步的计算时间（TFM实验的一个时间点）。K K水凝胶域中的力的平衡。遵循有限元法（FEM）程序并假设线性弹性行为，向前获得应力和牵引力Tk（方程10）。（E.4）最后，为结果可视化生成.vtk 文件。此步骤的所有结果都存储在输出文件夹F_tractions中。2.2.5. 输出和其他软件功能在计算完整的工作流程之后，用户可能对使用不同参数重复特定步骤而同时保留先前步骤感兴趣。GUI允许跳过从工作流的特定步骤开始的步骤，而不是运行整个流程。用户选择的所有参数都存储在.mat文件中，以确保重现性。所有重要的输出数据（处理后的图像、位移场、力场等）存储在.mat和文本文件中，以便进一步分析由用户与.vtk可视化文件一起，TFMLAB还为Paraview存储了一个.psvm模板，用于自动3D矢量场渲染。3. 示例代码段分析（可选）3.1. 说明性实例在本节中，我们将展示一个性能示例使用从血管生成的体外模型实验获得的数据，其中人脐静脉内皮细胞（HUVEC）侵入含有悬浮的200 nm荧光珠的聚乙二醇（PEG）实验方案和显微镜成像的更多详细信息见附录A。对于该示例，我们获取了细胞和珠图像堆栈（29029045 µm），在细胞松弛素D松弛细胞之前和之后通过共聚焦显微镜观察（见图4）。2a-d和补充视频1和2），体素大小为0.57 0.57 0.5µ m3.该数据集随TFMLAB包提供。使用TFMLAB分析该数据的概述在补充视频3中提供。首先，通过应用高斯差分（DoG）滤波器来处理珠图像以增强珠的球形形状和噪声去除，然后进行对比度拉伸操作（参见图2e-h）。接下来，通过应用基于惩罚最小二乘的去噪[ 43 ]处理细胞图像，并通过应用Otsu阈值处理和去除小的二进制对象来分割细胞体（见图1）。2i-k）。最后，通过应用基于相位相关的刚性图像配准来消除由显微镜载物台引起的移位（参见图13）。 2 l-0）。 在偏移校正之前，存在影响图像的所有珠的明显偏移（图1）。2升，n）。偏移校正后，仅剩下的珠运动发生在芽周围，表明图像处理后，非刚性位移的FFD测量和PBNIM方法被应用到恢复细胞的力量。图3a显示了TFMLAB在FE网格化之前，可以进一步平滑单元表面，以简化网格化过程。用户可以调整和可视化在计算力之前得到的FE网格对于这个例子，最终的有限元网格有90000个4节点三维线性四面体单元。基于实验结果，弹性模量设定 为 200 Pa ， 泊 松 表 2 显 示 了 在 Intel Core i7-7700 CPU 3.60GHz、Windows操作系统和16 GB RAM上完成 TFMLAB中这些数字不包括在参数调整上投入的时间，对于有经验的用户来说，这可能是10分钟左右，其中大部分时间花费在图像过滤、细胞分割和FE网格化上。结果显示，在芽尖附近有一个清晰的牵拉模式，导致高达6 µm的基质位移（见图1）。3b）。恢复的牵引力在细胞突起的尖端处呈现最大值，约为150 Pa（见图2）。3c）。虽然在血管生成芽周围的这种位移场模式已经在之前的研究[30]，[44这可能是一个重要的工具，用于量化细胞力学行为的3D，ECM模拟水凝胶，无论是单细胞以及多细胞结构和应用，如疾病建模，再生医学和组织工程以及发育生物学。第4节讨论了TFMLAB的其他优势。4. 影响通过这项工作，我们提供了一个易于使用和通用的开源代码来执行4D TFM，使具有各种（包括有限）技术背景的研究人员可以访问先进的细胞下面列出了与机械生物学领域有关的TFMLAB的值得注意的特征这是一个目前，运行计算3D TFM的典型这导致了调整输入数据以确保软件之间的兼容性的耗时工作。相比之下，研究人员在TFMLAB中拥有他们需要的所有工具它包括在多项TFM研究中证明有用的最新技术水平方法[26其GUI特别为编程经验有限的研究人员提供了易用性，并允许查看各个步骤和参数调整的作 为 TFMLAB 的 一 个 子 模 块 ， 另 一 个 商 业 软 件 （ 即Abaqus）可作为一个复杂的技术FE求解器。然而，为了最大限度地减少对商业软件的依赖，我们集成了FreeFEM，这是Abaqus的开源替代品此外，用户只需要很少的有限元建模 知 识 ， 因 为 只 需 要 基 本 的 参 数 调 整 （ 通 过 TFMLABGUI）。···TFMLAB步骤计算时间（s）图像滤波25.71轮班计算2.33移前校正19.72细胞分割9.86位移测量63.43移后校正31.71力计算56.15总计（分钟）3.48·Jorge Barrasa-Fano，Apeksha Shapeti，Álvaro Jorge-Peñas等人软件X 15（2021）1007235图二. TFMLAB中的图像处理步骤。（a，b）通过共聚焦显微镜获得的应力和松弛图像的3D呈现（绿色的细胞通道，红色的珠子通道）。（c，d）从原始的受压和松弛图像放大区域。（e，f）图像滤波之前和之后的珠图像的最大投影和增强。（g，h）在图像滤波和增强之前和之后放大区域。(i)原始细胞图像的最大强度投影。(j)过滤细胞图像和分割边界的最大(k)所得细胞分割的3D渲染（Paraview）。（l，m）偏移校正前后应力（绿色）和松弛（红色）微珠图像的最大强度投影重叠（n，o）在偏移校正之前和之后放大区域比例尺：100µ m。（关于此图例中颜色的参考解释，请读者参考本文的网络版本它是通用的，因为它可以处理不同的3D TFM方法。目前的研究包括基于珠粒的TFM [20，47，48]和基于纤维的TFM（具有纤维网络，例如通过无标记技术如二次谐波产生或共焦反射显微镜成像）[23，27，49]。我们的软件包括两种标记物的特定图像过滤器，FFD算法可处理这两种标记物[27，30]。此外，用户可以运行经典TFM问题（使用应力图像和松弛图像，如第3节中的示例）或延时TFM（使用应力图像序列和一个松弛图像）。如果研究人员实验协议不包括细胞成像，基于基准标记的位移计算仍然是可能的。我们的工具箱的紧凑性，用户友好性和多功能性使其可用于研究细胞基质力学发挥重要作用的许多生理或病理过程这种工具可以成为解开细胞机械与其3D微环境的时间依赖性相互作用的关键，这是最近机械生物学研究的前沿[25，30，49，50]。·Jorge Barrasa-Fano，Apeksha Shapeti，Álvaro Jorge-Peñas等人软件X 15（2021）1007236图3.第三章。（ a）用于FE网格划分和力计算的GUI。（b）通过PBNIM计算的芽尖周围的3D位移场（箭头）的3D渲染（Paraview）(c)通过PBNIM计算的芽尖端周围牵引场（箭头）的3D渲染（Paraview）5. 结论TFMLAB是一个开源MATLAB工具箱，旨在使4D TFM更接近不一定具有强大技术背景的医学和生物研究人员，从而促进TFM技术从（生物医学）工程和/或（生物）物理主导的研究环境向医学和生物学的过渡计算4D细胞力的所有必要步骤都包含在一个易于使用的软件包中（显微图像读取和处理、位移测量、力恢复和可视化文件生成）。我们证明了该软件的实用性和效率，在一个例子中使用真实的实验数据。我们希望研究人员会发现TFMLAB有用的独立的编程或技术背景。CRediT作者贡献声明Jorge Barrasa-Fano：概念化，方法论，软件，形式分析，数据管理，写作-原始草稿，写作-评论编辑，可视化，资金获取。Apeksha Shapeti：调查，写作-原始草案，写作- 审查编辑，资金收购。阿尔瓦罗·豪尔赫-佩尼亚斯：概念化，方法论，软件，写作-评论编辑。Mojtaba Barzegari：软件，写作-评论编辑。José Antonio Sanz-Herrera：方法论，软件，资源，写作-评论编辑，监督，资金获取。 汉斯·范·奥斯特威克：资源，写作-评论编辑，监督，资金获取。竞合利益作者声明，他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系，可能会影响本文报告的工作致谢作者感谢Marie-Mo Vaeyens博士，Mar Cóndor博士和Janne deJong的宝贵代码测试和反馈。作者还感谢Ranga实验室提供用于水凝胶制备的PEG前体。JBF 由佛兰德研究基金会（FWO）支持（国外长期停留的旅行补助金，FWO补助金V413019N）。JBF和H.V.O.由KU Leuven内部资金C14/17/111支持。A.S.由FWO SB资助1S68818N支持。 M. B.由 FWO 项目 G 085018 N 和 Prosperos 项目支持， 由Interreg VA Flanders - The Netherlands计划资助，CCI资助号2014TC 16 RFCB 046。J.A.通过项目PGC 2018 -097257-B-C31，获得了西班牙教育、文化和体育部的José Castillejo 奖学金（资助号CAS17/00096）和西班牙经济和竞争力部（MINECO）的支持。高压氧由欧洲研究理事会根据欧盟第七框架计划（FP 7/2007-2013）/ERC赠款协议编号308223），FWO赠款（G 087018 N）和FWO/Hercules基础设施赠款（G 0 H6316 N）支持。财政支持得到了充分的认可。Jorge Barrasa-Fano，Apeksha Shapeti，Álvaro Jorge-Peñas等人软件X 15（2021）1007237×××（）（）1uc−u c2个以乌赫−uh2附录A. 实验方案在完全内皮生长培养基（EGM-2，Lonza）中培养市售的合并野生型人脐静脉内皮细胞（HUVEC，Angio-Proteomie），并在第4代使用。在水凝胶制备前一天，用腺病毒LifeAct-GFP 2（同上）转导HUVEC酶促交联的聚乙二醇（PEG）水凝胶，其包含MMP敏感性肽修饰的PEG前体（8臂40 kDa），Lys-RGD 肽 （ Pepmic ） 和 0.1μ M 鞘 氨 醇 -1- 磷 酸 （ Sigma-Aldrich ） 用 0.2μm 红 色 荧 光 羧 化 聚 苯 乙 烯 微 球（ThermoFischer）悬浮。PEG so-将溶液移液到先前描述的[30]成像室中，该成像室连接到皮氏培养皿的玻璃底部，并进一步使其在室温下交联30分钟。然后通过在每个凝胶中接种50，000个LifeAct转导的HUVEC并孵育培养皿来在37° C，5%CO2下垂直放置，以使细胞粘附到PEG上弯月面最后，加入EGM-2，并在实验前将培养皿使用Leica SP8倒置共聚焦显微镜用25 × 0.95 NA水浸物镜对侵入PEG水凝胶的芽进行成像，29045µm，z间距为0.5µm。绿色荧光细胞通道和红色荧光珠通道同时成像以获得两组图像;第一组是当珠子处于应力状态并且细胞收缩时，第二组是当珠子处于松弛状态并且细胞不收缩时。在将培养皿放置在台上并定位感兴趣的芽之后，立即对应力状态进行成像然后通过用细胞松弛素D（溶于DMSO，Sigma Aldrich）中50分钟，然后在相同位置进行图像采集。附录B. 可用的图像过滤器为了过滤微珠图像，TFMLAB利用荧光微珠的球形形状，并结合高斯差分（DOG）滤波器[51]、对比度拉伸操作和高斯平滑。DOG算子包括减去原始图像的两个模糊版本，Ioriginal：I过滤=I原始Gσ1−I原始ΣGσ2（B.1）其中Gσ是具有标准偏差σ，σ1<σ2的高斯滤波器，并且σ 2是卷积算子。σ1和σ2的值对应于GUI中的参数在此操作之后，会发生一些对比度损失。为了对此进行校正，在较低强度值和较高强度值之间剪切I滤波的直方图，然后进行线性对比度拉伸操作（水平对应于GUI中的参数“对比度拉伸[最小值，最大值]”）。最后，将图像与具有标准偏差σ3（值对应于GUI中的参数对于处理细胞和纤维图像，TFMLAB提供了通过应用对数变换来增加图像暗区强度的可能性。对数变换放大具有较低强度值的体素的强度。这可能在细胞的荧光或细胞外基质的荧光不明显的情况下是有用的附录C.为FFD算法选择网格间距决定用FFD测量的位移场的平滑性的主要参数是网格间距。在FFD中，我们使用定义B样条非刚性变换的控制点的均匀网格。此栅格由栅格节点之间的间距定义。间距越大，位移测量的全局性越强（因此，将获得更平滑的结果）。间距越小，可以捕获的局部位移越多。对于TFM应用，通常搜索局部变形（通常在细胞突起周围，与图像的大小相比，细胞突起很小）。8到16个体素之间的网格间距对于恢复局部变形通常是可接受的选择甚至更低的网格尺寸的可能问题是，不规则变形（例如，远离单元的相对高的局部位移）可能出现在网格中。图像中没有可以引导配准的珠子的部分。根据我们的经验，大约5µ m的网格间距（相当于本文中使用的9个体素大小）提供了位移场模式，我们可以清楚地看到细胞突起周围的位移更高位移远离细胞衰减。此外，通过这种设置，我们通常不会获得不规则的变形。这是TFMLAB中网格间距的默认值，但用户可以在位移场测量之前在GUI中对其进行修改。附录D. FE的平滑和尺寸选择对于牵引力恢复，可以利用平滑选项和利用网格化元件的尺寸来大量操纵单元很难推荐最佳平滑和网格尺寸值，因为细胞形态高度不均匀，细胞分割的平滑度取决于成像质量。作为经验法则，应当最小化平滑的量，因为太多的平滑可能导致丢失细胞表面的重要结构，细胞表面是恢复牵引力的关键区域。建议稍微平滑单元表面，以消除网格化后可能出现的尖峰（请参见补充视频3中的示例），但始终控制单元几何形状的一般形状。我们根据我们以前的工作选择有限元的大小来网格化细胞表面和水凝胶域[31，32]。我们建议其他实验室进行事先的敏感性分析，以适应这些参数，以自己的图像特征。例如，它们可以恢复针对网格尺寸的一组递减值的牵引力，并识别牵引力幅度的范围不会显著变化的尺寸。元素的大小越小，计算成本越高。因此，应该在数值精度和计算效率之间找到一个附录E. 通过PBNIM进行PBNIM首先是在非线性弹性的背景下发展起来的。在[31]中提供了该方法的数值实现的详细描述。如[32]所述，TFMLAB使用线性弹性的适应性实现。简而言之，该方法计算位移场ucalc，其与测量的位移场umeas最小不同，并且其被强制以实现水凝胶域中的力的平衡作为约束。这可以用数学公式表示如下，来自纤维的信号在某些区域是低的图像然后被使用[43]中描述的基于惩罚最小二乘的去噪算法进行滤波。这种方法在保持（1次计算测量）2计算平均值2）Ch图像中的边缘，同时抑制噪声。最后，还应用对比度拉伸操作来补偿平滑后的对比度损失。S. t.Fh=0（E.1）minu计算，u计算22Jorge Barrasa-Fano，Apeksha Shapeti，Álvaro Jorge-Peñas等人软件X 15（2021）1007238|Cminu计算，u计算Cuc−u c2+乌鲁河−uh2+Θ·ηHηH0其中F是节点反作用力矢量，其说明了外部或内部规定的力或位移，c和h表示细胞边界域和水凝胶域，req。使用FEM框架并包括作为拉格朗日乘子的（B.1）可以改写为：（1次计算测量值为2次，1次计算测量值为2次）CH22[10] 森 信 仁 MATLAB PIV 工 具 箱 。2020 年 ， 【 上 线 】 。 可 用 网 址 ：http://www.oceanwave.jp/softwares/mpiv/[访问日期：2020年4月7日]。[11] 放大图片作者：Blair D，Dufresne E. Matlab粒子跟踪2020年，【上线】。可用网址：http://site.physics.georgetown.edu/matlab/[访问日期：2020年4月7日]。[12] 汉森公司Regtools -文件交换- MATLAB中心。 2020年，【上线】。可用：https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/52-regtools[ 访 问日期：2020年4月7日]。[13]弗兰克实验室下载Francklaboratory. 2020年，【上线】。可用网址：https://www.franck.engin.brown.edu/downloads[访问日期：2020年4月7日]。其中，Θ是平衡约束方程，η是拉格朗日乘子。最小的Eq。（E.2）可以解析计算，并以矩阵形式重写为（详细信息或公式在[32]中给出），Matter2014;10（23））：4047 -5 5 ， Roy al Soc ie ty of Ch em is try .[15] 黄Y，Gompper G，Sabass B.一个贝叶斯牵引力显微镜方法与自动降噪在一个用户友好的软件包。Comput.物理通信2020;107313.[16]HanSJ，Oak Y，Groisman A，Danuser G. 牵引显微镜，I 0Kch计算器umeas识别亚分辨率粘连中的力调制。Nature Methods2015;12（7）：653-6.0IKhh[17]曾泉 牵引力显微镜-imagej插件。 2020年，[上-行]。可用网址：https://sites.google.com/site/qingzongtseng/tfm[访问日期：2020年4月7日]。[18] Song D，Hugenberg N，Oberai AA. 三维牵引显微镜其中Khc，KchKhh是刚度矩阵与两个域C和H相关联。TFMLAB假设单元内部域的刚度可以忽略不计（杨氏接下来，在单元（e）的每个高斯点处的应变场被计算为：ε（e）=B·u计算（e）（E.4）其中B是形状函数的梯度矩阵。应力张量基于线性弹性、各向同性和均匀本构性质在单元（e）的每个高斯点处计算为，σ（e）=2μ·ε（e）+λ· tr（ε（e））I（E.5）其中μ和λ是水凝胶的Lamé常数。然后从高斯点到FE网格的节点i对σ（e）求使用柯西关系在单元边界域计算牵引力，Ti=σi·ni（E.6）其中，Ti是FE网格的节点i处的牵引力矢量，ni是节点i的向外法线。附录F. 补充数据与本文相关的补充材料可以在https://doi.org/10.1016/j.softx.2021.100723上找到。引用[1] Kraning-Rush CM，Califano JP，Reinhart-King CA.细胞牵拉应力随着转移潜能的增加而增加。PLoS One2012;7（2）.[2] Jansen KA，Bacabac RG，Piechocka IK，Koenderink GH.细胞通过产生收缩应力主动地收缩纤维蛋白网络。Biophys. J. 2013;105（10）：2240-51.[3] Schwarz US，Soiné JRD.软弹性基底上的牵引力显微镜：最近计算进展指南。Biochim Biophys Acta-Mol CellRes2015;1853（11）：3095-104.[4] Kutys ML ，Chen CS. 3D 血管生物 学中的力和机械转 导。Curr Opin CellBiol，42，Elsevier Ltd; 2016，p.七三比九[5] Mulligan JA，Bordeleau F，Reinhart-King CA，Adie SG.用于牵引力光学相干显微镜的体外动态细胞诱导三维位移场的测量。Biomed Opt Express2017;8（2）：1152。[6] Polacheck WJ ， Chen CS. 测 量 细 胞 产 生 的 力 ： 可 用 工 具 指 南 。 NatureMethods 2016;13（5）：415-23.[7] 邓博M，王永良。成纤维细胞运动过程中细胞-基质界面的应力。Biophys.J. 1999;76（4）：2307-16.[8] Balaban其他NQ。力和焦点粘附组装：使用弹性微图案基底研究的密切关系。Nat Cell Biol2001;3（5）：466-72.[9] Engler AJ，Sen S，Sweeney HL，Discher DE.基质弹性指导干细胞谱系特化。Cell2006;126（4）：677-89.用纤维本构模型。Comput. 方法应用机械工程2019;357：112579.[19] Legant WR，Miller JS，Blakely BL，Cohen DM，Genin GM，Chen CS.三维基质中细胞施加的机械牵引力的测量。Nature Methods2010;7（12）：969-71.[20] Gjorevski N，Piotrowski AS，Varner VD，Nelson CM.动态张力驱动集体细胞迁移通过三维细胞外基质。Sci. Rep. 2015;5：11458.[21] Cóndor M，García-Aznar JM.基于迭代有限元法求解牵引力显微镜反问题。计算方法程序Biomed2019;182：105056。[22] Lejeune E，Khang A，Sansom J，Sacks MS. FM-Track：用于在三维环境中研究细胞力学的基准标记跟踪软件。11.第十一章[23] Steinwachs 等 人 J. 生 物 聚 合 物 网 络 中 细 胞 的 三 维 力 显 微 镜 。 NatureMethods2016;13（2）：