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首页定位虎纹捕鸟蛛毒素-IV二硫键:部分还原与分步测定法揭秘
本文主要探讨了"部分还原和分步序列测定法定位虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅳ的二硫键结构"这一主题。研究人员刘中华和梁宋平通过对虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅳ的实验分析,揭示了这种神经毒素的分子特性。他们选择在酸性环境(pH=3)和适宜温度(40℃)下使用三羧甲基磷酸(TCEP)作为还原剂,将毒素中的二硫键逐一还原。通过高效液相色谱(RP-HPLC)技术,他们分离并收集了一对和两对二硫键被还原后的中间体。 接着,这些中间体与碘乙酰胺溶液反应,将游离的巯基进行烷基化处理,以便后续进行氨基酸序列测定。这种方法确保了对二硫键配对方式的准确解析,结果显示虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅳ的三个二硫键配对分别是Cys2-Cys17, Cys9-Cys24和Cys-Cys31,对应序列为1-4, 2-5和3-6。这种定位对于理解毒素的三维结构和功能至关重要,因为二硫键在维持蛋白质稳定性和活性方面扮演着核心角色。 虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅳ作为一种含35个氨基酸残基的肽类神经毒素,具有独特的6个半胱氨酸,这些半胱氨酸的二硫键配对模式与抑制剂胱氨酸结结构模式相符,这表明毒素家族可能共享相似的进化和结构特征。作者还提到,HWTX-Ⅳ与其他类似毒素如HWTX-I、TxP5、HaTX1和HaTx2存在同源性,这为预测其他毒素的结构提供了线索。 这项研究不仅深化了我们对虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅳ二硫键结构的认识,也为研究类似毒素的结构和功能提供了科学依据,对于毒素生物学和药物设计领域具有重要意义。
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部 分 还 原 和 分 步 序 列 测 定 法 定 位
虎 纹 捕 鸟 蛛 毒 素 -Ⅳ 二 硫 键
刘中华, 梁宋平
(湖南师范大学生命科学学院, 长沙 410081)
摘要 结合部分还原和分步序列测定法确定了虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅳ的二硫键配对方式. 在pH = 3 和40 ℃的条
件下与还原剂三羧甲基磷酸(T C E P )反应 10 m in, 利用 R P -H P L C 分离并分别收集含有一对和 两对二硫键被
还原的中间体, 分别与 0.5
m ol
/
L
碘乙酰胺溶液(
pH
= 8.3)反应 1
m in
, 使游离巯基烷基化后, 测定各中间体
的氨基酸序列, 从而确定虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅳ的 3 对二硫键分别为
C ys
2-
C ys
17,
C ys
9-
C ys
24 和
C ys
-
C ys
31
(1-4, 2-5 和 3-6).
关键词 虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅳ; 二硫键定位; 三羧甲基磷酸; 部分还原; 序列测定
中图分类号
O
62,
Q
5,
Q
5-3 文献标识码
A
文章编号 0251-0790(2003)10-1815-05
收 稿日 期: 2002-09-17.
基 金项 目: 国 家自 然科学 基金(批 准号: 39370152)资助 .
联 系人 简介: 梁宋 平(1946 年 出生), 男 , 博 士, 教授, 博士 生导师 , 从 事多肽 化学研 究.
E
-
m ail
:
liangsp
@
public
.
cs
.
hn
.
cn
虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅳ(H uw entoxin-Ⅳ, 简称 H W T X -Ⅳ)是从虎纹捕鸟蛛粗毒中分离得到含 35 个氨
基酸残基的肽类神经毒, 其中6 个半胱氨酸残基形成3 对二硫键;
H W T X
-Ⅳ的分子量为4 107.5, 其一
级结构为 EC L E IFK A C N PSN D Q CC K SSK LV C SR K T R W C K Y Q I; 电生理研究表明, H W T X -Ⅳ是一种
新型的神经性钠离子通道阻断剂
[1]
.
至今已在蜘蛛粗毒中发现了大量的毒素多肽, 虽然这些毒素多肽的一级结构和生物学功能都互不
相同, 但通过其空间结构发现这些毒素多肽都采用相同的空间结构模式(抑制剂胱氨酸结结构模式,
inhibitor
-
cystine
-
knot m otif
)和相同的二硫键配对方式(1-4, 2-5 和 3-6). 进一步研究表明, 二硫键对
于维系这类多肽的核心结构有十分关键的作用
[2~ 4]
. 通过将
H W T X
-Ⅳ与上述毒素多肽的一级结构进
行比较, 发现H W T X -Ⅳ与H W T X -I, T xP 5, H aT X 1 和H aT x2 等毒素多肽
[5]
具有较高的同源性, 都包
含6 个半胱氨酸, 其中2 个为邻位半胱氨酸, 且半胱氨酸的位置有一定保守性, 因而二硫键定位对于预
测
H W T X
-Ⅳ的空间结构模式具有十分重要的作用, 为通过2
D N M R
技术解析其溶液构象打下了基础.
同时也为同一类型的多肽分子的二硫键定位提供了参考方法.
多步酶切或化学降解法(
M ultiple
-
step enzym atic or chem ical digestion
)是最常用的蛋白质二硫键
定位方法. 利用多种酶或化学试剂裂解蛋白质 Cys 之间的肽链得到只含一对二硫键的肽片段, 通过质
谱测定裂解混合物的肽质指纹图谱, 或经
H PL C
分离后通过
Edm an
降解测定该片段的序列进行二硫键
定位
[6]
. 由于多数酶解在碱性条件下进行, 二硫键交换(
scram bling
)几率大大增加; 而且对于某些抗酶
解或含有邻位半胱氨酸的蛋白质无法通过酶解得到全套特征片段, 难以进行二硫键定位. H W T X -Ⅳ
含有邻位半胱氨酸, 而在
C ys
9-
C ys
16 之间的肽链没有合适的酶解位点, 无法采用酶解法进行二硫键
定位, 为此需要探索新的二硫键定位方法.
二硫键的构象能量(conform ationalenergy)以及与还原试剂接近程度因其在蛋白质的空间结构上
分布不同而各不相同, 即各二硫键的还原动力学不相同, 因而二硫键可在还原剂的作用下被选择性地
还 原, 实验证 明 T C E P 是一种合适 的还原剂
[7~ 9]
. 鉴于此, 本文报道了利用 T E C P 选择性地还 原
H W T X
-Ⅳ, 并通过
R P
-
H PL C
分离反应混合物, 收集部分还原的中间体与碘乙酰胺反应, 烷基化修饰
游离的—SH 后测定其序列, 从而确定了 H W T X -Ⅳ的二硫键配对方式, 整个实验过程如图 1 所示.
V ol.24 高 等 学 校 化 学 学 报 N o.10
2 0 0 3 年 10 月 C H E M IC A L JO U R N A L O F C H IN E SE U N IV E R SIT IE S 1815~1819
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