构建及功能验证：rAAV-hGAD65重组载体用于帕金森病治疗研究

本文研究的中心是构建rAAV-hGAD65重组载体，这是一种结合了腺相关病毒(AAV)和人类GAD65基因的创新策略。GAD65，即谷氨酸脱羧酶2，是一种关键的神经递质代谢酶，它在帕金森病(Parkinson's disease, PD)的发病机制中扮演着重要角色，因为它能够将谷氨酸转化为抑制性神经递质γ-氨基丁酸(GABA)，从而调节神经网络的兴奋性。 首先，研究人员通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从人胚胎端脑组织中成功克隆出了GAD65基因的cDNA。这个过程确保了获取到的是与人类GAD65基因序列一致的基因片段，这对于后续的基因工程至关重要。将克隆得到的hGAD65基因与AAV载体进行连接，形成rAAV-hGAD65重组载体，这种载体的选择是因为AAV病毒具有非整合的特性，能安全地将基因导入宿主细胞，且有良好的体内递送能力。 接下来，作者通过体外实验验证了rAAV-hGAD65的功能。他们包装配制了重组AAV病毒，并测定病毒滴度达到4.5×1011/ml，表明病毒的纯度和产量较高。然后，他们利用成纤维细胞作为实验模型，结果显示病毒能够有效地感染这些细胞，感染效率约为80%。这一步骤对于评估基因在细胞内的表达情况至关重要。 进一步，研究人员通过高效液相色谱(HPLC)分析被感染细胞的上清液，发现GABA的含量为45.66±6.07 nmol/L，证实了重组病毒成功诱导了GAD65的活性，实现了谷氨酸向GABA的转化。这一发现对于理解GAD65在帕金森病治疗中的潜在作用提供了实验证据。 本文的成果不仅构建了一种新型的基因疗法工具，也为帕金森病的治疗策略开辟了新的可能性。通过rAAV-hGAD65的体外功能检测，研究人员展示了将GAD65基因递送到特定神经区域的可能性，这为未来的基因治疗研究和临床应用奠定了基础。未来的研究可能进一步探索这种策略在动物模型或人体临床试验中的效果，以期改善帕金森病患者的运动障碍症状。