PCR与RT-PCR：纯度测定关键参数与应用详解

PCR (聚合酶链反应) 是一种生物技术，由Kary Mullis在1983年发明，因其对分子生物学领域的重大贡献，他于1993年荣获诺贝尔化学奖。PCR的核心原理是利用DNA聚合酶在体外进行DNA复制，通过设计特定的引物对，能够在短时间内扩增目标DNA片段。这项技术的发明极大地推动了基因检测、疾病诊断、遗传研究等领域的进展。 纯度测定是PCR实验中的关键步骤，它涉及评估样品中的核酸质量和浓度。首先，对提取的总RNA进行浓度测定，通过计算260纳米(A260)吸光度值与280纳米(A280)的比值（通常在1.8-2.0范围内），可以估算RNA的纯度，因为纯RNA在这些波长下的吸光度比值相对恒定。若比值过高，可能表示存在蛋白质或染料等杂质；过低则可能RNA降解或纯度较低。浓度测定则是通过上述比值乘以40并考虑稀释倍数来计算RNA的实际浓度（单位通常为ug/ml）。 PCR和RT-PCR（逆转录PCR）是两种密切相关但略有区别的技术。RT-PCR是在PCR的基础上增加了一个额外步骤，即逆转录（RT）。当需要从RNA样本中获取cDNA（互补DNA）时，先通过逆转录酶将RNA转化为cDNA，再进行后续的PCR扩增。这使得能够检测和分析RNA序列，特别是在转录本水平的研究中，如基因表达分析。 在实际操作中，进行RT-PCR的步骤包括：首先将RNA与逆转录酶、随机引物和dNTPs混合，然后进行5分钟的高温变性使RNA解旋；接着加入逆转录缓冲液在37℃下进行长时间反应；完成逆转录后，产物可以直接用于PCR或先进行电泳分析，确认分子完整性后再进行扩增。此外，优化PCR条件，如温度、循环次数和引物设计，以及防止实验室污染（例如使用一次性耗材、严格清洁等），都是PCR实验成功的关键要素。 PCR与RT-PCR作为基础且强大的分子生物学工具，不仅改变了我们对基因结构和功能的理解，而且在科研、医疗诊断等多个领域发挥着不可或缺的作用。通过精确的纯度和浓度测定，科学家能确保实验数据的准确性和可靠性，从而推动科学研究的深入发展。