PrimerExpress v3.0指南：实时PCR引物与探针设计详解

荧光定量PCR引物设计软件PrimerExpress操作指南是一份详细的技术文档，针对PrimerExpress v3.0版本提供了一系列关于引物和探针设计的建议与步骤。该指南主要适用于实时定量PCR实验中的引物设计，特别是在使用TaqMan探针技术时。TaqMan探针是一种特殊的探针，通常包含一个报告基团（如FAM染料）和一个淬灭基团，用于区分不同的碱基配对，从而实现高度特异性和准确性。 设计原则包括： 1. 引物长度：推荐50-150bp，确保PCR扩增效率和产物的可分析性。 2. G/C含量：理想的G+C含量应在30-80%之间，以维持稳定的Tm值并增强PCR反应的稳定性。 3. Tm值：对于定量检测（Quantification assay），引物的Tm值应设定在68-70℃；而对于等位基因歧视检测（Allelic Discrimination assay），Tm值则在65-67℃。探针的Tm值范围为58-60℃，TaqMan MGB探针（带有镁离子存在下的额外碱基）可能有所不同。 4. 探针设计：TaqMan探针长度通常为13~25个或13~30个碱基，而优化的引物长度通常为20个碱基。探针的设计需考虑探针结构，如含有GGG-MGB-3'或GGAG-MGB-3'末端，以及避免连续的CC二核苷酸以防止二级结构形成。 使用PrimerExpress v3.0软件进行自动化设计的过程如下： 1. 新建项目：File→New→选择“TaqMan MGB Quantification”模板。 2. 导入DNA序列：通过Tools→"Add DNA File"功能导入目标序列，支持多种文件格式，如PrimerExpress软件自身格式(.dan, .txt, .ab1, .abi等)或从数据库下载。 3. 设计双链DNA：在“Double Strand”选项下，提供工具来排除特定碱基，可以使用"ExcludeSelectedBases"功能剔除不需要的区域。 4. 结合"Junction"参数：如果实验涉及接头或特殊结构，可能需要调整特定的Junction设计规则，以确保引物的高效结合和PCR扩增的成功。 这份指南提供了详尽的指导，帮助用户通过PrimerExpress软件设计出适合于实时定量PCR的引物和探针，确保实验结果的可靠性和准确性。