PrimerExpress：荧光定量PCR引物设计与操作指南

"荧光定量PCR引物设计软件说明书(PrimerExpress_guide).pdf" 荧光定量PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction, qPCR）是一种广泛应用于基因表达分析、病原体检测和遗传变异研究的技术。 PrimerExpress 是一款由Thermo Fisher Scientific公司开发的专业引物设计软件，用于设计适用于荧光定量PCR的引物和探针。本说明书主要涉及PrimerExpress v3.0版本的操作指南，专注于实时PCR（Real-Time PCR）中的引物和探针设计。 1. 引物和探针设计准则： - 引物长度：理想情况下，引物长度应在50-150碱基对（bp）之间。 - G/C含量：G/C比例应保持在30%-80%之间，以确保良好的特异性。 - Tm值（熔解温度）：对于定量分析（Quantification assay），Tm值推荐在68-70℃；对于等位基因歧视分析（Allelic Discrimination assay），Tm值建议在65-67℃。 - 探针长度：TaqMan MGB探针的长度通常为13-25个碱基，而TaqMan探针的长度则在13-30个碱基之间。 - 探针设计：3'端应避免G，推荐使用FAM荧光染料标记，探针的3'端可以是GGG-MGB或GGAG-MGB结构。 2. PrimerExpress操作流程： - 打开软件，选择"File" → "New"，然后选择"TaqMan MGB Quantification"模板。 - 使用"Tools" → "Add DNA File"导入目标序列，支持.dan, .txt, .ab1, .abi等多种文件格式。 - 在"Sequence"标签下复制并粘贴待设计引物的双链DNA序列。 - 避免设计在不利区域：可以使用"ExcludeSelectedBases"排除不希望设计引物的位置。 3. 设计优化： - 为了避免引物二聚体和非特异性结合，软件提供了"Exclude"功能来排除特定区域。 - 双链DNA序列分析：选择"Double Strand"选项，软件将考虑整个序列的双链结构。 - 约束条件设置：根据实验需求，可以设定其他参数如长度、G/C含量、二级结构等进行优化设计。 4. TaqMan MGB探针： - TaqMan MGB探针具有MGB（Minor Groove Binder）结构，能提高探针的特异性和稳定性。 - 探针3'端的CC二核苷酸可防止非特异性扩增，增加实验的可靠性。 通过PrimerExpress，用户可以根据特定的实验需求，高效地设计出适合荧光定量PCR的引物和探针，从而确保实验的准确性和可靠性。软件的自动化设计功能极大地简化了设计过程，同时，其提供的各种参数调整选项确保了引物和探针的质量，满足了不同实验的复杂需求。