构建NPM-ALK融合蛋白表达载体及在Jurkat细胞中的稳定表达

"甄红、王松等人通过构建融合蛋白NPM-ALK的真核表达载体，旨在在哺乳动物细胞中稳定表达这种具有强致癌活性的蛋白质，特别是针对T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat。他们成功构建了重组质粒pEGFP-N1-NPM-ALK，并在293T细胞和Jurkat细胞中实现了稳定表达，为后续的NPM-ALK在血液肿瘤发病机理和治疗研究提供了实验基础。" 本文主要涉及以下几个关键知识点： 1. **融合蛋白NPM-ALK**: NPM-ALK，即核仁磷酸蛋白（NPM）与间变性大淋巴细胞激酶（ALK）形成的融合蛋白，是一种已知的致癌因子，常见于某些类型的白血病和淋巴瘤中。它的形成通常是由于染色体易位事件导致NPM基因与ALK基因的异常结合。 2. **真核表达载体构建**: 在哺乳动物细胞中表达外源基因通常需要利用真核表达载体。在这个研究中，研究人员采用pEGFP-N1载体，这是一个广泛使用的表达绿色荧光蛋白（GFP）的质粒，通过插入NPM-ALK基因，使其成为一个可以同时表达GFP和NPM-ALK的载体。 3. **亚克隆技术**: 亚克隆是将目标DNA片段插入到载体DNA中，以创建含有特定基因序列的重组DNA分子的过程。在本文中，亚克隆被用来将NPM-ALK基因插入到pEGFP-N1载体中。 4. **细胞转染**: 转染是将外源DNA引入哺乳动物细胞的技术。293T细胞（人胚肾细胞）和Jurkat细胞（T淋巴细胞白血病细胞株）被用作研究模型，分别进行了瞬时和稳定转染，以验证和建立NPM-ALK的表达。 5. **G418筛选**: G418是一种抗生素，可以杀死未成功导入重组质粒的细胞，从而筛选出稳定表达目的基因的细胞。在这个实验中，Jurkat细胞被筛选以获得持续表达NPM-ALK的细胞系。 6. **流式细胞术**: 这是一种用于分析和分选单个细胞的高通量技术，基于细胞的物理特性或标记蛋白。在本文中，它用于筛选和鉴定GFP阳性的Jurkat细胞，这些细胞表达了重组质粒。 7. **荧光显微镜和RT-PCR检测**: 荧光显微镜用于可视化GFP表达，证明细胞已经成功表达NPM-ALK。RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）则用于检测NPM-ALK mRNA的表达，确认基因转录活动。 8. **Western Blot**: 是一种蛋白质检测技术，用于验证NPM-ALK蛋白的表达。通过这种方法，研究人员可以确认细胞不仅转录了NPM-ALK基因，还成功翻译成了蛋白质。 这项研究成功建立了稳定表达NPM-ALK的Jurkat细胞系，这为深入理解NPM-ALK在白血病发生和发展中的作用，以及可能的治疗策略提供了重要的实验工具。