构建与鉴定mpCDH-CMV-RFP慢病毒载体用于miRNA稳定表达

"重组慢病毒表达载体mpCDH-CMV-RFP的构建及鉴定，徐静云，胡敏敏，分子病毒学研究" 这篇论文详细介绍了如何构建和验证一个用于稳定表达microRNAs的重组慢病毒表达载体mpCDH-CMV-RFP。慢病毒是一种能够高效转导多种类型细胞的基因传递工具，特别适用于在哺乳动物细胞中的基因疗法和研究应用。在这个研究中，科研人员的目标是创建一个能稳定表达特定microRNA的系统。 首先，研究者利用PCR技术从pTRIPZ质粒中扩增出红色荧光蛋白(RFP)的编码基因以及miRNA-30的茎环结构和侧翼序列。这些序列随后被插入到pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体中，形成新的重组质粒mpCDH。这个mpCDH载体包含了一个CMV启动子，它能驱动RFP基因的表达，同时也有能力容纳并表达miRNA序列。 接着，科研人员采用三质粒系统，即重组目的质粒mpCDH、包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G，共同转染入人胚肾上皮细胞（293T细胞）。通过观察293T细胞中RFP的表达，评估了转染效率。有效的转染会使得293T细胞显示红色荧光，从而确认了重组质粒的成功导入。 收集到的病毒液经过梯度稀释法测定其滴度，这是一种评估病毒浓度的方法。然后，研究者以miR-134-3p为例，将其前体序列插入mpCDH慢病毒载体，生成阳性对照Lentivirus-miR-134-3p（Lv-miR-134-3p）。将重组慢病毒Lv-mpCDH和Lv-miR-134-3p分别感染宫颈癌HeLa细胞，通过荧光定量PCR（RT-qPCR）检测miR-134-3p的表达水平。 实验结果显示，重组慢病毒质粒mpCDH通过限制性内切酶酶切鉴定和核酸序列比对得到验证，成功构建。重组慢病毒感染HeLa细胞后，通过RT-qPCR分析，证实了mpCDH载体能够有效介导miR-134-3p的稳定表达。 这项研究成功地构建了一种新型的慢病毒载体mpCDH-CMV-RFP，该载体不仅可以稳定表达红色荧光蛋白，还能够有效地传递和表达特定的microRNA序列，为后续的microRNA功能研究和基因治疗提供了有力的工具。